100 doc#1281 Pošreizejuo adrese: OX11 0DE, Apvīnuotuo Karaliste, Dimanta āka, Harvela zynuotnis i inovaceju parks, Diekota, Oksfordšīra, Apvīnuotuo Karaliste, Dimanta gaismys olūtu kompaneja, Elektroniskuo biologiskuo attāluošonys centrs.
Reakcejis centra gaismys īvuokšonys komplekss 1 (RC-LH1) ir violetuos fototrofūs baktereju pamata fotosintetiskuo sastuovdaļa. Mes īvīsem divejis RC-LH1 kompleksa krioelektronu mikroskopejis strukturys nu Rhodopseidomonas palustris. RC-LH114-W kompleksa 2,65 Å izškiertspiejis struktura sastuov nu 14 apakšvīneibu LH1 cylpu, kas apjam RC, kū puortrauc proteins W, bet komplekss bez proteina-W ir piļneibā RC sastuovs, kū īskaun RC. Slēgts 16 apakšvīneibys LH1 cylpa. Itūs strukturu saleidzynuošona snādz īskotu hinona dinamikā RC-LH1 kompleksā, tymā skaitā īprīkš nanūteiktuos konformacejis izmainis, saistūt hinonu RC QB vītā, kai ari paleighinona saisteišonys vītu atsarasšonys vītā, kas paleidz tūs nūdūt iz RC. W proteina unikaluo struktura naļaun aizvērt LH1 cylpu, taidā veidā veidojūt kanalu hinonu/hinolonu apmainis pauotrynuošonai.
Fotosintezis nūdrūsynuotuo energeja var uzturēt gondreiž vysu dzeiveibu iz Zemis, tai ir lels saulis biotehnologejis potencials. Veicynojūt globalū fotosintezi, violetajom fototrofiskajom bakterejom ir ari dažaidi energejis veidi i vīlmainis spiejis. Tī var izavaireit nu fotosintezis i augt kai heterotrofys bakterejis tymsā, var fiksēt sluopekli i ūglekļa dioksidu, ražuot iudiņradi i sadaleit aromatiskūs savīnuojumus (1-3). Kab nūdrūsynuotu energeju itim procesim, gaisma ir dreiži i efektivi juopuorvierš kimiskajā energejā. Itys process suocās, kod gaismu īgiušonys antenys komplekss absorbej gaismu i puornas īgiutū energeju iz reakcejis centru (RC), taidā veidā suocūt luodeņu atdaleišonu (4 – 7). Fotosintezis pamatvīneiba violetuos fototrofuos bakterejuos sastuov nu 2. tipa RC, kū īskaun gaismys īvuokšonys komplekss 1 (LH1), veidojūt RC-LH1 kūdula kompleksu. LH1 veidoj izlīktu αβ heterodimeru sakuortuojums, nu kurūs kotrs saista divejis baktereju hlorofila (BChl) molekulys i vīnu voi divejus karotinoidus (8-12). Vīnkuoršuokuo LH1 antena sastuov nu 16 voi 17 αβ heterodimerim, kas īskaun RC (9-13) slāgtā cylpā, bet cytūs kūdula kompleksūs transmembranu peptidi puortrauc apleicejuo LH1 napuortraukteibu, Taidā veidā veicynojūt hinola/hinona kompleksu i bRC11). 13.–15.). Violetais fototrofiskais augs Rhodopseudomonas (Rps.) ir paraugorganisms, kas var saprast energejis i elektronu puornesšonu, kas atbolsta fotosintezi. Pyrmuo kristala struktura Rps. Palustris RC-LH1 kompleksa modeļs ir RC, kū īskaun 15 heterodimerys LH1 cylpys, kurys puortrauc nazynoms proteins, kū sauc par “Protein W” (14). Piec tam ūlboltumvīlys-W tyka identificāts kai RPA4402, kas ir naraksturuots 10,5 kDa ūlboltumvīlys ar treis prognozātom transmembranys spiralem (TMH) (16). Mes īrūsynojam puorsaukt rpa4402 genu, kas kodej proteinu W, par pufW, kab atbylstu nomenklaturai, kū izmontoj genim, kas kodej RC-L, M (pufL, pufM) i LH1α, β (pufA, pufB) apakšvīneibys. Interesanti, ka proteins-W ir tikai apmāram 10% RC-LH1, atkluojūt Rps. palustris ražoj divejus dažaidus RC-LH1 kompleksus. Ite mes ziņojam par diveju kūdula kompleksu augstys izškiertspiejis krio-EM (krio-EM) strukturom, vīns ar proteinu W i 14 αβ heterodimerim, ūtrys bez proteina W i slāgtys 16 heterodimeru LH1 cylpys. Myusu struktura puorstuov sūļu izmainis Rps RC-LH1 kompleksa izpratnē. palustris, partū ka asam analizējuši kotra varianta vīndabeigu populaceju i ir pīteikama izškiertspieja, kab skaidri pīškiertu kotru peptidu i saisteitūs pigmentus i saisteitūs lipidus i hinonus. Itūs strukturu saleidzynuošona paruoda, ka treis TMH proteini-W, kas leidz šam nav atrosti nivīnā cytā RC-LH1 kompleksā, roda hinona kanalu, kab pauotrynuotu hinona/hinolona apmaiņu. Ir konstatātys vairuokys konservātys lipidu i hinonu saisteišonys vītys, i mes asam atkluojuši jaunys konformacejis izmainis piec hinonu i RC kombinacejis, kas var byut pīmāruotys skuobekļa fototrofūs organismu fotosistemai II (PSII) RC. Myusu atkluojumi snādz jaunus īskotus hinona/hinolona saisteišonuos i apmainis kinetikā violetuos fototrofūs baktereju RC-LH1 kūdula kompleksā.
Kab atvīgluotu detalizātu diveju kompleksu izpieti, kas atrūnami Rps. palustris, mes izolejam kotru RC-LH1 ar biokimiskom metodem. Ūlboltumvīlu W tryukuma komplekss (turpmuok saukts par ΔpufW) tyka atteireits nu calma, kuram tryukst pufW gena (16), var ražuot tik vīnu RC-LH1 kompleksu. Ūlboltumvīlu W saturūšū kompleksu ražoj calms. Ituo calma proteinu W puorveidoj ar 10 reizis His marku tuo C-golā, kab proteinu W saturūšū kompleksu varātu efektivi apvīnuot ar leluokū daļu tryukuma proteina W, imobilizejūt metalu. Komplekss ir efektivi atdaleits (16) Afinitatis hromatografeja (IMAC).
Kai paruodeits 1. attālā, obejūs kompleksūs ir treis apakšvīneibys RC (RC-L, RC-M i RC-H), kū īskaun LH1 antena. Kompleksa, kam tryukst proteina-W, 2,80-A strukturā ir 16 αβ heterodimerus, veidojūt slāgtu LH1 cylpu, kas piļneibā apjam RC, kū turpmuok sauc par RC-LH116 kompleksu. Ūlboltumvīlu W saturūšuo kompleksa 2,65 Å strukturai ir 14 heterodimers LH1, kū puortrauc ūlboltumvīlys W, turpmuok saukts par RC-LH114-W.
(A un B) Savīnuojuma viersa attāluojums. (C un D) Salītī pigmenti, kas izteikti stieņūs. (E i F) Nu citoplazmys viersa nūvāruotajim kompleksim ir peptidi i LH1 apakšvīneibys, kas attāluotys karikaturuos, i tī ir numurāti stuņdinīka ruodeituoja vierzīnī nu proteina-W plaisys [atbylst Rba numeracejai. sferoidu komplekss (13)]. LH1-α proteina apakšvīneibys kruosa ir dzaltona; LH1-β proteina apakšvīneibys kruosa ir zyla; proteinam-W proteins ir sorkons; RC-H, tys ir cians; RC-L, tys ir Oranžs; par RC-M, purpura. Kofaktorus attāloj stymbyni, zaļš apzeimej BChl i BPh a molekulys, violets apzeimej karotinoidus, bet dzaltons apzeimoj UQ10 molekulys. (G i H) Palelynuots skots iz proteina-W plaisu RC-LH114-W kompleksa (G) i RC-LH116 kompleksa (H) ekvivalentajā regionā. Kofaktori teik paruodeiti telpys pīpiļdeišonys veidā, helātais hinons ir paruodeits zylā kruosā. Proteina-W plaisa ir izcalta ar zylu streipuotu lineju (G), bet mozī caurumi, kur hinons/hinolols izplyust iz LH116 gradzyna, ir izcalti ar malnu streipuotu lineju (H).
attālā (A i B) paruodeits RC, kū īskaun atvārti voi slāgti LH1αβ heterodimeru bloki, nu kurim kotrs saista divejus BChl i vīnu karotinoidu (1. att., C i D). Īprīkšejī pietejumi ir paruodejuši, ka Rps ir LH1 komplekss. Spirulinys ksantina biosintezis ceļā itamuos suguos ir jauktys karotinoidu populacejis (17). Tok spiropiroksantins ir dominejūšais karotinoids i tuo bleivums ir apmīrynūšs. Deļtuo mes izavieliejom modelēt spiroksantinu vysuos LH1 saisteišonys vītuos. Alfa i beta polipeptidi ir atseviški TMH ar eisim membranys uorejim apgobolim (1. att., A, B, E i F). Koč i 17 atlykumu bleivums C-golā natyka nūvāruots, alfa polipeptids obejūs kompleksūs tyka sadaleits nu Met1 iz Ala46. β polipeptids tyka samazynuots nu Gly4 iz Tyr52 RC-LH116, i nu Ser5 iz Tyr52 RC-LH114-W. Natyka nūvāruots 3 voi 4 N-gola voi 13 C-gola atlykumu bleivums (S1 att.). Nu savvalis tipa calma sagataveituo jauktuo RC-LH1 kompleksa masys spektrometrejis analize paruodeja, ka tryukstūšais regions ir itūs peptidu heterologiskuos saškeļšonys rezultats (S1 i S2 att.). Nūvāruota ari α-Met1 N-gola formiliešona (f). Analize paruodeja, ka α-peptids sastuov nu atlykumu fMet1 leidz Asp42/Ala46/Ala47/Ala50, bet β-peptids sastuov nu atlykumu Ser2 leidz Ala53, kas labi saskan ar zamuos temperaturys EM bleivuma karti.
α-His29 i β-His36 koordinaceja padora BChls aci pret aci; kotrs αβ heterodimers sasavīnoj ar sovim sābrim, veidojūt atvārtu cylpu (RC-LH114-W) voi slāgtu cylpu (RC-LH116) ap RC Eksitonu savīnuotais pigmentu sakuortuojums (1. att., C i D). Saleidzynojūt ar RC-LH114-W 877 nm jūslu, RC-LH116 880 nm absorbcejis sorkonuo nūbeide ir 3 nm (2. att. A). Tok apļveida dihroisma spektrs ir gondreiž vīns i tys pats (2. att. B), kas nūruoda, ka, koč ari ir skaidra atškireiba storp atvārtom i slāgtom cylpom, BChls vītejuo vide ir cīši leidzeiga. Absorbcejis sorkonuo nūbeide var byut samazynuotys termiskuos kusteibys i palelynuotys stabilitatis rezultats iz slāgtuos cylpys (18, 19), slāgtuos cylpys izraiseituos pigmenta savīnuošonys izmainis (20, 21) voi itūs diveju efektu kombinacejis (11).
(A) Ultravioletais/radzamais/tyvai infrasorkonais absorbcejis spektrs, kura viersyunis ir apzeimuotys ar attīceigajim pigmentim i normalizātys leidz BPh viersyunei pi 775 nm. (B) Apļveida dihroisma spektrs, kas normalizāts leidz BChl absorbcejai 805 nm. (C i D) Izlaseiti ΔA spektri nu RC-LH114-W kompleksa (C) i RC-LH116 kompleksa (D) laika izškiertū absorbcejis spektru. Lobuokai saleidzynuošonai vysi spektri teik normalizāti leidz ∆A nu −A pi 0,2 ps. (E) Citohroma c2 oksidacejis uotrums piec apstaruošonys dažaidu UQ2 koncentraceju kluotbyutnē (izejdatim vērtīs S8 attālā). (F) Šyunuos, kas audzātys zamys, videjis voi augstys intensitatis gaismā (attīceigi 10, 30 voi 300μMm-2 s-1), proteina W i RC-L apakšvīneibys atteireitajā kompleksā i atdaleituos membranys attīceiba. Nūsoka proteina leimini ar SDS-poliakrilamida gela elektroforezi i imunotestu (izejdatus vērtīs S9 attālā). Nūteikt attīceibu attīceibā pret atteireitū RC-LH114-W kompleksu. Kompleksa RC-L i proteina-W stehiometriskuo attīceiba ir 1:1.
BChls 1. pozicejā RC-LH114-W deformātajā αβ14 cylpā (1. att., A, C, E) ir tyvuok RC primarajam donoram (P) par 6,8 Å nakai ekvivalentī BChls RC-LH116 (1. att., F, B, D att.); tok obeju kompleksu puorīmūšuo absorbcejis kinetika paruoda, ka RC-LH114-W i RC-LH116 īrūsynuošonys energejis puornesšonys laika konstantis nu LH1 iz RC ir 40 ±4 i 44±3 ps (2. att.). , C un D, ​​S4 attāls un S2 tabula). Taipat nav byutisku atškireibu elektroniskajā puornesšonā RC ītvorūs (S5 att. i ar tū saisteitais papyldu teksts). Myusim ir aizdūmys, ka energejis puornesšonys laika cīšuo atbiļsteiba storp LH1 i RC-P ir saisteita ar leidzeigu leluokuos dalis BChl attuolumu, leņki i potencialuos energejis obejuos LH1 cylpuos. Ruodīs, ka LH1 energejis modeļa izpiete, kab sasnāgtu minimalū attuolumu, nav dreižuoka par tīšu energejis puornesšonu nu suboptimalu vītu iz RC. Atvārtuos cylpys LH1 cylpa RC-LH114-W var pīdzeivuot ari nanūzeimeigu termiskū kusteibu zamys temperaturys apstuokļūs strukturalai analizei, ustobys temperaturā nu βBChls pigmentacejis attuoluma RC 1 pozicejā ir garuoka αβ14 gradzyna konformaceja.
RC-LH116 kompleksā ir 32 BChls i 16 karotinoidi, i tuo kūpejais izkuortuojums ir taids pats, kas dabuots nu Termohromatija (Tch.) pidpiduma [Ūlboltumvīlu datu banka (PDB) ID 5Y5S (9), tiorhodovibriju PDB7T9r. (12) un zaļōs aļģes (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10). Piec sakuortuošonys nūvāruoja tikai nalelys nūvierzis αβ heterodimeru pozicejuos, eipaši 1-5, 15 i 16 (S6 att.). Proteina-W kluotbyutne byutiski ītekmej LH1 strukturu. Tuo treis TMH ir savīnuoti ar eisom cylpom, ar N-golu kompleksa lūmena pusē i C-golu citoplazmys pusē (1.A i 3. att., nu A leidz D). Ūlboltumvīlys-W lelā mārā ir hidrofobisks (3. att. B), i TMH2 i TMH3 sovstarpeigai īsadorboj ar LH1αβ-14, veidojūt transmembranys viersu (3. att. B i E leidz G). Saskarsmi golvonūkuort sastuov nu Phe, Leu i Val atlīkom transmembranys regionā. Itī atlykumi ir sakrauti ar hidrofobom aminoskuobem i αβ-14 pigmentim. Sovstarpeigū darbeibu veicynoj ari daži polarī atlykumi, tymā skaitā iudiņraža saite storp W-Thr68 i β-Trp42 iz kompleksuo dobuma viersa (3. att., F i G). Iz citoplazmys viersa Gln34 ir sūpluok αβ-14 karotinoidu keto grupai. Pi tam tyka atrysynuota n-dodecila β-d-maltozida (β-DDM) molekula, i tuos hidrofobiskuo aste pasaplašynuoja leidz proteina-W i αβ-14 saskarsmei, i lipidu aste var atsarast organismā. Mes ari pamanejom, ka proteina W i RCH C-terminaluos izškiertspiejis regioni ir cīši tyvi, bet na specifisku sovstarpeigūs darbeibu veiduošonys jūmā (1. att., A i E). Tok var byut sovstarpeiguo īdarbeiba itūs diveju proteinu naatrysynuotajuos C-gola aminoskuobuos, kas var nūdrūsynuot mehanismu proteina-W pīsaisteišonai RC-LH114-W kompleksa montažys laikā.
(A) Protein-W, kas ir vārsts iz saskarsmi ar LH1αβ14 karikaturu formā, ir stieņa formys suonu kēde (sorkona), kas paruodeita elektrostatiskuo potenciala diagramys daļā (caurspeideiga pelēka viersma ar konturys leimini 0,13). (B) Ūlbaltumvīlys-W, kū attāloj hidrofobisks kruosys vierss. Polarī i uzluodātī apgoboli ir paruodeiti cyānā kruosā, hidrofobī apgoboli ir boltā, bet stypri hidrofobī apgoboli ir paruodeiti oranžā kruosā. (C i D) Ūlboltumvīlys-W attāluots karikaturuos, tuo orientaceja ir taida poša kai (A) (C), i pagrīzts par 180° (D). Piec pozicejis seceibā atškireigī atlykumi pījam varavīksnis kruosu shemu, kur N-terminals ir zyls, bet C-terminals ir sorkons. (E) Proteins-W taidā pošā skotā kai (A), i atlykumi proteina-W:LH1 saisteibā ir attāluoti ar stymbynim ar pīvīnuotom zeimem. (F) Protein-W ir pagrīzts par 90° attīceibā pret (E) i LH1αβ14 karikaturu attāluojumā i attīceibā pret saskarsmis atlīkom stygu attāluojumā. Beta polipeptida puorkareiguos atlīkys ir markietys. Kofaktors ir paruodeits kai streipe, kas atbylst 1. attāla kruosai, sadaleitais β-DDM ir paruodeits pelēkā kruosā, bet skuobeklis ir paruodeits sorkonā kruosā. (G) Skots (F) ir pagrīzts par 180°, ar radzamim markietuo alfa polipeptida palīkim.
Ūlboltumvīlys W aizstuoj αβ heterodimeru (15. 1.F attālā), taidā veidā nūvieršūt cylpys aiztaiseišonu i pyrmūs treis αβ heterodimeru nūlīkšonu. Tyka nūvāruots, ka pyrmuo αβ-1 heterodimera maksimalais sleipuma leņkis attīceibā pret plēvis normalū beja 25° leidz 29° (1. att., A i E), kū veiduoja αβ-1 slīksnis nu 2° leidz 8° RC A oss kontrasts-LH116 i F1. att., B). Ūtrais i trešais heterodimers ir nūlīkts attīceigi nu 12° leidz 22° i nu 5° leidz 10°. RC steriskūs škieršļu deļ αβ-1 sleipums naīkļaun ūtrū αβ puori (kas atbylst 16. αβ 1. F attālā), taidā veidā veidojūt skaidru plaisu LH1 gradzynā (1. att., A i E). Sakarā ar diveju αβ heterodimeru tryukumu, kū pavoda četru BChl i diveju karotinoidu zaudiešona, nivīns nu karotinoidu nasaista ar vītuotū αβ-1 apakšvīneibu, kuo rezultatā roduos LH114-W gradzyns, kas satur 13 karotinoidus vegetarīšus i 28 BChls. Diveju kompleksu vītejuos izškiertspiejis apriekini αβ1 leidz 7 regionūs ir zamuoki par puorejuos LH1 cylpys, kas var atspīgeļuot LH1 apakšvīneibys rakstureigū plastiskumu, kas atsarūn sūpluok RC QB vītai (4. att.).
RC-LH114-W (A un B) un RC-LH116 (C un D) attāli ir rōdeiti nu vīna un tō poša augšejas skota/sōnu skota (A un B) (A un C) un 1. att. Kruosainī taustekli ir paruodeiti pa labi.
Vīneigais cyts rakstureigais kūdula komplekss ar stehiometriskū attīceibu 1:14 ir rodokoku sferoidu (Rba.) RC-LH1-PufX dimers (13). Tok proteinam W i PufX nav acimradzamys homologejis i tī byutiski ītekmej tūs attīceiguos LH1 strukturys. PufX ir vīns TMH ar N-gola citoplazmys domenu, kas sovstarpeigai īsadorboj ar RC-H apakšvīneibys (13) citoplazmys pusi pozicejā, kas atbylst Rps. 116αβ-16. PufX veidoj kanalu hinonu/hinolonu apmaiņai storp RC-LH1 i citohroma bcl kompleksu i ir kluotyn vysā Rba. sferoidu kūdula komplekss (13). Koč i monomera i monomera saisteiba ir Rba. Sferoidu RC-LH1-PufX dimers atsarūn proteina W saistūšajā pozicejā RC-LH114-W, i PufX i proteina-W izraiseituo plaisa atsarūn leidzvierteigā pozicejā (S7A attāls). Plaisa RC-LH114-W ir saskaņuota ari ar Pseudomonas rosea LH1 hipotetiskū hinona kanalu (8), kū veidoj peptidi, kas nav saisteiti ar proteinu W voi PufX (S7B attāls). Bez tuo hinona kanals Blc. Smaragdzaļais LH1, kas izaveiduojs, izslādzūt vīnu γ apakšvīneibu (7), atsarūn leidzeigā pozicejā (S7C att.). Koč i tū veicynoj dažaidi proteini, ruodīs, ka itūs hinona/hinolola kanalu pasaruodeišona kūpejā pozicejā RC-LH1 kompleksā ir konvergentys evolucejis pīmārs, kas nūruoda, ka proteina W radeituo plaisa var dorbuotīs kai hinona kanals.
Plaisa LH114-W cylpā ļaun veiduot napuortrauktu membranys regionu storp RC-LH114-W kompleksa īkšejū telpu i leluokū membranu (1. att. G), navys savīnuot obejus domenus caur proteina porom, kai tys ir proteinūs. RC-LH116 komplekss ir leidzeigs slāgtam Tch. Adatai leidzeigs komplekss (22) (1H att.). Tai kai hinona izplateiba cauri membranai ir dreizuoka par izplateibu cauri šaurajam proteina kanalam, atvārtuo LH114-W cylpa var ļaut dreizuokai RC apgrīzīņam nakai slāgtuo LH116 cylpa, i hinona izplateiba RC var byut īrūbežuotuoka. Kab puorbaudeitu, voi proteins W ītekmej hinonu puorviersšonu caur RC, mes veicem citohroma oksidacejis testu iz nūteiktys ubihinona 2 (UQ2) koncentracejis (dabiskuo UQ10 analogs ar eisuoku izoprena asti) (2. att. E). Koč i helatātuo hinona kluotbyutne traucej precizi nūsaceit škītamū Mihaelis konstantu (RC-LH114-W i RC-LH116 ir pīmāruoti attīceigi 0,2±0,1μM i 0,5±0,2μM), maksimalais RC-LH1,RC114-0) uotrums ir. ± 5% leluoks par RC-LH116 (3,6 ± 0,1 e-RC-1 s-1).
Suokumā apriekinuojom, ka proteins-W ir apmāram 10% kūdula kompleksa (16); ite mozgaismys, videjuos gaismys i augstys gaismys augšonys šyunu aizjimteibys ruodeituoji ir attīceigi 15±0,6%, 11±1% i 0,9±0,5 % (2. att. F). Masys spektrometrejis kvantitativais saleidzynuojums paruodeja, ka histidina markys pīvīnuošona nasamazynuoja proteina-W relativū daudzumu, saleidzynojūt ar sovvalis tipa calmim (P = 0, 59), partū itī leimini nav modificātuo proteina-W artefakts (S10 att.). Tok itei zamuo proteina-W aizjimteiba RC-LH1 kompleksā var ļaut dažim RC apsagrīzt dreizuokā uotrumā, taidā veidā mazynojūt lānuokū hinonu/hinolonu apmaiņu RC-LH116 kompleksā. Mes pamanejom, ka augstais gaismys aizjimteibys leimiņs nasaskan ar jaunuokajim transkriptomikys datim, kas nūruoda, ka pufW genu ekspresija pīaug styprā gaismā (S11 att.) (23). Atškireiba storp pufW transkripceju i proteina-W īkļaušonu RC-LH1 kompleksā ir mulsynojūša i var atspīgeļuot proteina sarežgeitu reguliešonu.
RC-LH114-W ir pīškierti 6 kardiolipini (CDL), 7 fosfatidilholini (POPC), 1 fosfatidilglicerins (POPG) i 29 β-DDM molekulys i tymā teik modelātys 6 CDL, 24 POPC, 2 POβDM i 12. RC-LH116 (5. att., A un B). Itamuos divejuos strukturuos CDL gondreiž atsarūn kompleksa citoplazmys pusē, bet POPC, POPG i β-DDM puorsvorā atsarūn luminalajā pusē. Divejis lipidu i mazgšonys leidzekļu molekulys tyka izolātys RC-LH114-W kompleksa αβ-1 leidz αβ-6 regionā (5. att. A), bet pīcys tyka izolātys RC-LH116 ekvivalentajā regionā (5. att. B ). Kompleksa ūtrā pusē tyka konstatāts vairuok lipidu, golvonūkuort CDL, kas uzakruoja storp RC i αβ-7 leidz αβ-13 (5. att., A i B). Cyti strukturali izškiertī lipidi i mazgšonys leidzekli atsarūn uorpus LH1 gradzyna, i labi izškiertys acila kēdis stīpās storp LH1 apakšvīneibom, kas provizoriskai apzeimuotys kai β-DDM RC-LH114-W i definātys kai β-DDM RC A βPOPC-DHDM i 16 maisejumā. Leidzeigys helatejūšūs lipidu i mazgšonys leidzekļu pozicejis myusu strukturā nūruoda, ka tuos ir fiziologiski nūzeimeigys saisteišonys vītys (S12A att.). Ekvivalentu molekulu pozicejom Tch ari ir loba konsistence. Maigi i Trv. 970 RC-LH1s calms (S12, B leidz E att.) (9, 12) i lipidu golvys grupys iudiņraža saišu atlīkys paruodeja dīzgon lobu saglobuošonu seceibys sakuortuošonā (S13 att.), kas nūruoda, ka Konservātais CDL, kas saistuos ar RC (24), ituos vītys var byut saglobuotys CHRCx-1.
(A i B) RC-LH114-W (A) i RC-LH116 (B) peptidi attāluoti ar karikaturu, a pigmenti attāluoti ar stieņim, izmontojūt kruosu shemu 1. attālā. UQ, kas saisteits ar RC QA i QB vītom, ir dzaltons, bet izolātais UQ ir zyls. (C i D) Taidi poši redzīni kai (A) i (B), ar lipidim izlaistim. (E leidz G) Paplašynuots skots iz Q1(E), Q2(F) i Q3(G) nu RC-LH116, ar sānu kēdem, kas ītekmej vīna ūtru. Iudiņraža saitis teik paruodeitys kai malnys sveitruotys linejis.
RC-LH116 gon RC QA, gon QB UQ, kas pīsadola elektronu puornesšonā luodeņa atdaleišonys procesā, teik sadaleitys sovuos saisteišonys vītuos. Tok RC-LH114-W QB hinons nav atrysynuots i par tū tiks detalizāti apsprīsts tuoļuok. Papyldu QA i QB hinonim RC-LH114-W strukturā teik sadaleitys divejis helātuos UQ molekulys (atsarūn storp RC i LH1 gradzynim) atbylstūši tūs labi izškiertajom golvys grupom (atsarūn attīceigi Q1 i Q2). vīta). 5C att.). Q1 ir pīškiertys divejis izoprena vīneibys, i bleivuma karte atrysynoj piļneigys 10 Q2 izoprena astis. RC-LH116 strukturā tyka atrysynuotys treis helatuos UQ10 molekulys (Q1 leidz Q3, 5D att.), i vysom molekulom ir skaidrs bleivums vysā astis (5. att., D leidz G). Divejuos strukturuos Q1 i Q2 hinonu golvys grupu pozicejom ir izcyla konsistence (S12F att.), i tuos sovstarpeigai īsadorboj tikai ar RC. Q1 atsarūn pi RC-LH114-W W spraugys īejis (1.G i 5. att., C, D i E), bet Q2 atsarūn pi QB saisteišonys vītys (5. att., C, D) i F). Konservātī L-Trp143 i L-Trp269 atlykumi ir cīši tyvi Q1 i Q2 i nūdrūšynoj potencialu π-kruošonys sovstarpeigū darbeibu (5. att., E i F, i S12. att.). L-Gln88, 3,0 Å nu Q1 distaluo skuobekļa, nūdrūšynoj stypru iudiņraža saiti (5. att. E); itei atlykuma sasagloboj vysūs RC, izjamūt vystuoluokū attīceibu (S13 att.). L-Ser91 ir konservativi aizstuots ar Thr leluokajā daļā cytu RC (S13 att.), ir 3,8 angstromi nu Q1 metilskuobekļa i var nūdrūsynuot vuojys iudiņraža saitis (5E att.). Ruodīs, ka Q3 nav specifiskys sovstarpeiguos darbeibys, bet tys atsarūn hidrofobiskā regionā storp RC-M apakšvīneibu i LH1-α apakšvīneibu 5.–6. (5. att., D i G). Tch ir atrysynuoti ari Q1, Q2 i Q3 voi tyvumā asūšī helatī hinoni. Maigs, Trv. Calms 970 un Blc. Īris struktura (9, 10, 12) nūruoda iz konservātu paleighinona saisteišonys vītu RC-LH1 kompleksā (S12G att.). Pīci sadaleitī UQ RC-LH116 labi saskan ar kotra kompleksa UQ 5,8±0,7, kū nūsoka ar augstys veiktspējys škidruos hromatografejis (HPLC), bet treis sadaleitī UQ RC-LH114-W ir zamuoki par Izmiereituo vierteiba 6,2±0,3 ir S4.att. struktura.
Pseidosimetriskī L i M polipeptidi kotrā satur pīcus TMH i veidoj heterodimeru, kas apvīnoj vīnu BChl dimeru, divejus BChl monomerus, divejus bakteriofagu (BPh) monomerus i vīnu na-hema dzeļzi i vīnu voi divejis UQ10 molekulys. Ar iudiņraža saišu kluotbyutni gola ketonu grupā i tuos zynomū uzakruošonu Rps, karotinoidi teik īkļauti M-apakšvīneibā, kū sauc par cis-3,4-dehidroorhodopinu. Sugys (25). RC-H uorejuos membranys domens ir pīstyprynuots pi membranys ar vīnu TMH. Kūpejuo RC struktura ir leidzeiga trejom radnīceigūs sugu (par pīmāru, Rba) RC apakšvīneibom. sfēroidi (PDB ID: 3I4D). BChl i BPh makrocikli, karotinoidu mugorkauls i nahema dzeļzs puorsakluoj itūs strukturu izškiertspiejis diapazonā, taipat kai UQ10 golvonuo grupa QA vītā i QB hinons RC-LH116 (S15 att.).
Diveju RC strukturu pīejameiba ar dažaidim QB vītys aizjimteibys ruodeituojim dūd jaunu īspieju izpieteit konsekventys konformacejis izmainis, kas pavoda QB hinonu saisteibu. RC-LH116 kompleksā QB hinons atsarūn piļneibā saisteitajā “proksimalajā” pozicejā (26), bet RC-LH114-W atdaleišonā nav QB hinona. RC-LH114-W nav QB hinona, kas ir puorsteidzūši, partū ka komplekss ir aktivs, vaira kai RC-LH116 komplekss ar strukturali izškiertu QB hinonu. Koč i diveji LH1 gradzyni helatej apmāram sešus hinonus, pīci ir strukturali izškierti slāgtajā RC-LH116 gradzynā, cikom tikai treis ir strukturali īrūbežuoti atvārtajā RC-LH114-W gradzynā. Itī palelynuotī strukturalī trauciejumi var atspīgeļuot dreizuoku RC-LH114-W QB vītu aizstuošonu, dreizuoku hinonu kinetiku kompleksā i palelynuotu īspiejameibu škārsuot LH1 cylpu. 100 doc#1281 Mes īrūsynojam, ka UQ tryukums RC-LH114-W RC QB vītā var byut sarežgeituoka i aktivuoka kompleksa rezultats, i RC-LH114-W QB vīta ir izreiz sasaļdejuse UQ apgrīzīnī Konkretais pūsms (īeja QB vītā ir slāgta itei konformacejis) ref.
Bez QB, leidza asūšuo L-Phe217 rotaceja iz poziceju, kas nav savīnojama ar UQ10 saisteibu, partū ka tys izraisīs telpiskū sadursmi ar pyrmū astis izoprena vīneibu (6. att. A). Bez tuo, acimradzamys golvonuos konformacejis izmainis ir acimradzamys, eipaši spirale de (īsuo spirale cylpā storp TMH D i E), kur L-Phe217 teik puorvītuots iz QB saistūšū kabatu i L-Tyr223 rotaceja (6. att. A ) Lai puortrauktu QB saistūšū ītvoru iudiņraža saiti ar M-4. vītā (6. att. B). Spirale de pivots tuos pamatnē, L-Ser209 Cα teik nūvītuots par 0,33Å, cikom L-Val221Cα teik nūvītuots par 3,52Å. 100 doc#1349 Nav nūvārojamu izmaiņu TMH D un E, kas ir pōrklōjamas obōs strukturōs (6. att. A). Cik zynoms, tei ir pyrmuo struktura dabiskā RC, kas aizver QB vītu. Saleidzynuojums ar piļneigū (ar QB saisteitū) strukturu paruoda, ka pyrma hinona samazynuošonys ir vajadzeigys konformacejis izmainis, kab tys īītu hinonā. L-Phe217 rotej, veidojūt π-kruošonys sovstarpeigū darbeibu ar hinona golvys grupu, i spirale puorsavītoj iz uoru, ļaunūt L-Gly222 skeletam i L-Tyr223 suonu kēdei veiduot iudiņraža saišu teiklu ar stabilu iudiņraža saišu strukturu (6. att., A i C).
(A) Hologramys (L kēde, oranžuo/M kēde, magenta) i apo (pelēka) strukturys puorsakluojūša karikatura, kurā golvonuos atlīkys teik paruodeitys stieņam leidzeiga attāluojuma veidā. UQ10 ir attāluots ar dzaltonu streipi. Punktāta lineja nūruoda iz iudiņraža saitem, kas izaveiduojušys vysā strukturā. (B i C) Apolipoproteina i vysys gradzyna strukturys viersa attāluojums, izceļūt L-Phe217 suonu kēdis skuobekli attīceigi zylā kruosā i L-Tyr223 sorkonā kruosā. L apakšvīneiba ir oranža; M i H apakšvīneibys nav kruosainys. (D i E) Apolipoproteina (D) i vasalu (E) RC QB vītys [kruosa attīceigi piec (A)] i Termofils termofils PSII (zaļš, zyls ar plastmasys hinonu; PDB ID: 3WU2) Izlīcynuot (58).
Nagaideiti, koč i ir pīejamys vairuokys QB deficita RC strukturys bez LH1, par itymā pietejumā nūvāruotajom konformacejis izmaiņom īprīkš nav ziņuots. Tī īkļaun QB izsludynuošonys strukturu nu Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Č. 100 doc#1281 (28) un Rba. sfaeroidi (PDB ID: 1OGV) (29), kas vysi ir gondreiž taidi poši kai jūs kūpejuo QB struktura. 3PRC ryupeiga puorbaude atkluoja, ka LDAO (Lauril Dimethyl Amine Oxide) mazgšonys leidzekļa molekulys saistuos QB pozicejis īejā, kas var nūvērst puorkuortuošonu slāgtā konformacejā. Koč i LDAO nasaškeļ vīnā i tamā pošā pozicejā 1EYS voi 1OGV, itī RC teik sagataveiti, izmontojūt vīnu i tū pošu mazgšonys leidzekli i deļtuo var radeit taidu pošu efektu. Rba kristala struktura. Ruodīs, ka ari sfaeroidim RC, kas kūpā izkristalizāti ar citohromu c2 (PDB ID: 1L9B), ir slāgta QB vīta. Tok itymā gadīnī RC-M polipeptida N-terminalais regions (sovstarpeigai īsadorbojūt ar QB saisteišonys vītu caur Tyr atlykuma H saiti iz Q spiralis) pījam nadabisku konformaceju, i QB konformacejis izmainis nateik tuoļuok pieteitys (30 ). Kas ir mīrynūšs, ka mes naasam redziejuši itaida veida M polipeptida deformaceju RC-LH114-W strukturā, kas ir gondreiž tys pats, kas RC-LH116 RC N-terminalais apgobols. Juoatzeimoj ari, ka piec mazgšonys leidzekļu bazis LH1 antenys izskausšonys tyka atrysynuoti apolipoproteinu RC PDB, kas likvidēja īkšejū hinonu baseinu i lipidus plaisā storp RC i apleicejuo LH1 gradzyna īkšejū viersu (31, 32). RC palīk funkcionals, partū ka sagloboj vysus kofaktorus, izjamūt sadalejamū QB hinonu, kas ir mozuok stabils i bīži teik zaudāts sagataveišonys procesā (33). Bez tuo ir zynoms, ka LH1 i dabiskūs cikliskūs lipidu izjimšona nu RC var ītekmēt funkcejis, par pīmāru, luodeņa atdaleituo P+QB-stuovūkļa saeisynuotū myuža ilgumu (31, 34, 35). Partū mes spekulej, ka vītejuo LH1 gradzyna asameiba, kas apjam RC, var uzturēt “slāgtū” QB vītu, taidā veidā saglobojūt vītejū vidi pi QB.
Koč i apolipoproteins (bez QB hinona) i piļneiguo struktura attāloj tikai divejus momentuzjimšonys nu QB vītys apritis, navys nūtykumu sereja, ir nūruodis, ka saisteibu var īrūbežuot, kab naļautu atkuortuoti sasaistēt ar hidrohinona Lai nūmīrynuotu substrata inhibiceju. Hinolola i hinona sovstarpeiguo īdarbeiba pi apolipoproteina QB vītys var byut atškireiga, kas nūvad pi tuo nūraideišonys ar RC. Jau seņ ir īrūsynuots, ka konformacejis izmaiņom ir nūzeime hinonu saisteibā i redukcejā. Sasaldātūs RC spieja samazynuot hinonus piec tymsys adaptacejis ir traucāta (36); Rentgenstoru kristalografeja paruoda, ka itī bojājumi ir saisteiti ar QB hinonu īsprūstuošonu “distalā” konformacejā ap 4,5 Å nu aktivuos proksimaluos pozicejis (26) , 37). Mes īrūsynojam, ka itei distaluo saistūšuo konformaceja ir momentuzjimšona nu storpstuovūkļa storp apolipoproteinu i pylnu gradzyna strukturu, kas sekoj suokūtnejai sovstarpeigai īdarbeibai ar hinonu i QB vītys atkluošonai.
II tipa RC, kas atrūnams dažu fototrofūs baktereju i zylaļģu, aļģu i augu PSII kompleksā, ir strukturala i funkcionala saglobuošona (38). attālā (D i E) paruodeitais strukturalais izkuortuojums pastreipoj leidzeibu storp PSII RC i baktereju RC kompleksa QB vītu. Itys saleidzynuojums jau seņ ir bejs paraugs cīši saisteitūs hinonu saisteišonys i redukcejis sistemu pieteišonai. Īprīkšejuos publikacejis līcynuoja, ka konformacejis izmainis pavoda hinonu PSII samazynuošona (39, 40). Deļtam, jamūt vārā RC evolucejis saglobuošonu, itys īprīkš nanūvāruotais saisteišonys mehanisms var byut pīmāruojams ari PSII RC QB vītai skuobekli ar fototrofiskajim augim.
Rps ΔpufW (namarkāta pufW izsliegšona) i PufW-His (C-gola 10x His markiets proteins-W, kas izsaceits nu dabiskuo pufW lokusa) calmi. palustris CGA009 tyka apraksteits myusu īprīkšejā dorbā (16). Itī calmi i izogenais sovvalis tipa vacuoks tyka atgiuti nu saldietuoja, izstreipojūt nalelu skaitu šyunu iz PYE (kotrs 5 g litru -1) (uzglobuots LB -80 °C, saturūt 50% ( m/t) glicerina) proteina, rauga ekstraktu i sukcinata (% pla]v) agaru/m.5. Pluoksni inkubēja nakti tymsā ustobys temperaturā anaerobūs apstuokļūs, piec tam izgaismuoja ar boltu gaismu (~50 μmolm-2 s-1), kū nūdrūsynuoja OSRAM 116-W halogena spuļdzis (RS Components, UK) 3–5 dīnys, cikom pasaruodeja vīna koloneja. Vīna koloneja tyka izmontuota, kab inokulātu 10 ml M22+ bareibys (41), kas papyldynuota ar 0,1% (m/t) kazaminskuobem (turpmuok par M22). Kultura tyka audzāta zamu skuobekļa apstuokļūs tymsā 34°C, kratejūt ar 180 apgr./min 48 stuņdis, piec tam 70 ml kulturys inokulēja taidā pošā apstuokļūs 24 stuņdis. Pusaerobū kulturu ar 1 ml tylpumu izmontoj, kab inokulātu 30 ml M22 bareibys 30 ml universalā skryuvis viersā caurspeideigajā stykla pudelē i apstaruotu ar maisejumu (~50 μmolm-2 s-1) 48 stuņdis ar sterilu magnetiskū spāku Maisšonys rod. Piec tam 30 ml kulturys taidā pošā apstuokļūs inokulēja ar apmāram 1 litru kulturys, kū piec tam 72 stuņdis inokulēja apmāram 9 litrus kulturys, kas apgaismuota ar ~200 μmolm-2 s-1. Šyunys tyka īvuoktys centrifugejūt 7132 RCF 30 minotys, atkuortuoti suspendeitys ~10 ml 20 mM tris-HCl (pH 8,0) i uzglobuotys -20°C, cikom vajadzeigs.
Piec atkauseišonys resuspendeitajom šyunom pīvīnoj dažus dezoksiribonukleazis I kristalus (Merck, Apvīnuotuo Karaliste), lizocima (Merck, Apvīnuotuo Karaliste) i divejis Roše holoenzima proteazis inhibitoru tabletis (Merck, Apvīnuotuo Karaliste). 000 psi fraņču spīdīņa šyunā (Aminco, ASV) šyunys tyka izjauktys 8 leidz 12 reizis. Piec nasalauztu šyunu i naškeidynojūšūs atkrytumu nūjimšonys, centrifugejūt 18 500 RCF 15 minutys 4°C, membranu nūguļsnēja nu pigmentātuo lizata, centrifugejūt 113 000 RCF 2 stuņdis 43 000 °C. Izmest škeidynojūšū frakceju i atkuortuoti suspendēt kruosainū membranu 100 leidz 200 ml 20 mM tris-HCl (pH 8,0) i homogenizēt, cikom nav radzamu agregatu. Suspendeitū membranu inkubēja 20 mM tris-HCl (pH 8,0) (Anatrace, ASV), kas satur 2% (m/t) β-DDM, 1 stuņdi tymsā 4°C, maigi maisūt. Piec tam centrifugej 70°C, kab izškeidynuotu 150 000 RCF 4°C 1 stuņdi, kab nūjimtu atlykušūs naškeidynojūšūs vīlus.
Škeidynojūšuo membrana nu ΔpufW calma tyka izlykta iz 50 ml DEAE Sefarozis jonu apmainis kolonys ar treis kolonu tylpumim (CV) saistūšuo bufera [20 mM tris-HCl (pH 8,0), kas satur 0,03% (m / t) β-DDM]. Kolonu izmozgoj ar divejim CV saistūšajim buferim, tod kolonu izmozgoj ar divejim saistūšajim buferim, kas satur 50 mM NaCl. RC-LH116 komplekss tyka eluāts ar linearu gradientu nu 150 leidz 300 mM NaCl (saistūšajā buferā) iz 1,75 CV, atlykušais saistūšais komplekss tyka eluāts ar saistūšū buferu, kas satur 300 mM NaCl iz 0,5 CV. Savuoc absorbcejis spektru storp 250 i 1000 nm, patur frakceju ar absorbcejis attīceibu (A880/A280) leluoku par 1 pi 880 leidz 280 nm, atšķaidej tū divejis reizis saistūšajā buferī i otkon izmontoj tū pošu proceduru iz DEAE kolonys Par atteireišonu. Atšķaideit frakcejis ar A880/A280 attīceibom, kas ir augstuokys par 1,7 i A880/A805 attīceibom, kas ir augstuokys par 3,0, veikt trešū jonu apmainis kuortu, i saglobuot frakcejis ar A880/A280 attīceibom, kas ir augstuokys par 2,2 i A880/A805 attīceibom, kas ir augstuokys par 0.0. Daleji atteireitais komplekss tyka koncentrāts leidz ~2 ml Amicon 100 000 molekularuo svora nūgrīzšonys (MWCO) centrbēdzes filtrā (Merck, Apvīnuotuo Karaliste) i īkruots iz Superdex 200 16/600 izmāra izslāgšonys kolonys (GE Healthcare, ASV), kas satur buferu NaC m 1,5 CV. Apkūpuot izmāra izslāgšonys frakcejis absorbcejis spektrus, i koncentrēt absorbcejis spektrus ar A880/A280 attīceibom puori 2,4 i A880/A805 attīceibom puori 5,8 leidz 100 A880, i izreiz izmontuot tūs krio-TEM režģa sagataveišonai voi uzglobuošonai Turēt pi -C°til8.
100 doc#1281 Škeidynojūšuo membrana nu PufW-His calma tyka izlykta iz 20 ml HisPrep FF Ni-NTA sefarozis kolonys (20 mM tris-HCl (pH 8,0), kas satur 200 mM NaCl i 0,03% (m/m)) Veseleibys buferā (GE). v) β-DDM]. Kolonu izmozguoja ar pīcim IMAC bufera CV, piec tam ar pīcim IMAC bufera CV, kas satur 10 mM histidina. Kūdula komplekss tyka eluāts nu kolonys ar pīcim IMAC buferim, kas satur 100 mM histidina. 100 doc#1281 Frakceja, kas satur RC-LH114-W kompleksu, teik koncentrāta leidz ~10 ml maiseitajā tvertnē, kas aprīkota ar Amicon 100 000 MWCO filtru (Merck, Apvīnuotuo Karaliste), atšķaideita 20 reizis ar saistūšū buferu, i tod pīvīnoj 25 ml koCVn buferā, iz prīšku. Kolonu izmozgoj ar četrim CV saistūšajim buferim, tod eluej kompleksu iz ostoņu CV iz linearuo gradienta nu 0 leidz 100 mM NaCl (saistūšajā buferī), i atlykušī četri CV, kas satur 100 mM saistūšū buferu Atlykušī kompleksi hlodejs A8de20. augstuoks par 2,4 i A880/A805 attīceiba augstuoka par 4,6 frakcejom tyka koncentrātys leidz ~2 ml Amicon 100 000 MWCO centrbēdzes filtrā, i pīpiļdeitys ar 1,5 CV IMAC īprīkš Bufers leidzsvoruots Superdex 200 izsvīsts buferā i izslāgts 16/600 . 1,5 CV. Apkūpuot izmāra izslāgšonys frakceju absorbcejis spektrus i koncentrēt absorbcejis spektrus ar A880/A280 attīceibom puori 2,1 i A880/A805 attīceibom puori 4,6 leidz 100 A880, kū iz reizis izmontoj sasaļdeita TEM režģa sagataveišonai voi uzgloboj leidz -80°C.
Zamys temperaturys TEM teiklu sagataveišonai tyka izmontuots Leica EM GP immersejis saldētuojs. Kompleksu atšķaideja IMAC buferī leidz A880 nu 50, piec tam 5 μl īkruove iz naseņ spīdūšu izlādušu QUANTIFOIL 1,2/1,3 ar ūglekļa puorkluotu vara teiklu (Agar Scientific, Apvīnuotuo Karaliste). Režģi inkubej 20°C i 60% relativā mytrā 30 s, tod 3 s izslaucej, tod škidrajā etanā -176°C apdzieš.
RC-LH114-W kompleksa dati tyka īraksteiti eBIC (Elektroniskais bioattāluošonys centrs) (Britu dimanta gaismys olūts) ar Titan Krios mikroskopu, kas dorbojās ar paātrynuošonys sprīgumu 300kV, ar nominalū energejis palelynuojumu 130 000 gap eV. Kab īraksteitu attālus skaiteišonys režimā, kab apkūpuotu datus, tyka izmontuots Gatan 968 GIF Quantum ar K2 pīku detektoru. Kalibrātais pikseļu izmārs ir 1,048Å, devys uotrums ir 3,83 e-Å-2s-1. Apkūpuoja kinu 11 sekundēs i sadaleja 40 daļuos. Izmontojit ar ūglekļa puorkluotu zonu, kab puorfokusātu mikroskopu, piec tam savuoc treis kinys iz vīna cauruma. Kūpumā tyka apkūpuotys 3130 kinys, ar defokusa vierteibom storp -1 i -3μm.
Dati par RC-LH116 kompleksu tyka apkūpuoti, izmontojūt tū pošu mikroskopu Asterberijis biostrukturys laboratorejā (Līdys universitate, Apvīnuotuo Karaliste). Dati tyka apkūpuoti skaiteišonys režimā ar palelynuojumu 130 k, pikseļu izmārs tyka kalibrāts leidz 1,065 Å ar 4,6 e-Å-2s-1 devu. Kina tyka īraksteita 12 sekundēs i sadaleita 48 daļuos. Kūpumā tyka apkūpuotys 3359 kinys, ar defokusa vierteibom storp -1 i -3μm.
Vysa datu apstruode teik veikta Relion 3.0 cauruļvadā (42). Izmontojūt Motioncorr 2 (43), lai izlobuotu kūka kusteibu piec devys svēršonys, i tod izmontojūt CTFFIND 4.1 (44), lai nūsaceitu CTF (kontrasta puornesšonys funkcejis) parametru. Tipiskī fotomikrografejis piec itūs suokūtnejūs apstruodis pūsmu paruodeitys 2. attālā.S16. Automatiskuo atlasis veidne teik izveiduota, manuali atlasūt apmāram 250 pikseļus nu 1000 daleņu 250 pikseļu kadrā i bez atsaucis divdimenseju (2D) klasifikacejis, taidā veidā nūraidūt tuos klasifikacejis, kas atbylst parauga pīsuorņuojumam voi kam nav radzamu eipašeibu. Piec tam iz vysom mikrofotografejom tyka veikta automatiskuo atlase, i RC-LH114-W beja 849 359 dalenis, bet RC-LH116 komplekss beja 476 547 dalenis. Vysys atlaseitys dalenis ir pīdzeivuojušys divejis naatsaucis 2D klasifikacejis kuortys, i piec kotra skriejīņa dalenis, kas atbylst ūglekļa laukumam, parauga pīsuorņuojums, nikaidys acimradzamys īzeimis voi stypri puorsakluojušys dalenis, teik nūraideitys, rezultatā teik izmontuotys 772 033 (90,9%) i 359,6578 klasifikacejis parD). RC-LH114-W un RC-LH116 attīceigi. Suokūtnejais 3D atsaucis modeļs tyka izveiduots, izmontojūt stohastiskuo gradienta nūsalaisšonys metodi. Izmontojūt suokūtnejū modeli kai atsauci, atlaseitys dalenis teik īdaleitys četruos kategorejuos 3D. Izmontojūt modeli itamā kategorejā kai atsauci, veic 3D rafiniešonu iz daleņom leluokajā kategorejā, tod izmontoj suokūtnejū 15Å zamuos caurlaideibys filtru, kab apsegtu škeidynuotuoja laukumu, pīvīnoj 6 pikseļus meikstuos molys, i piecapstruodi pikseļus, kab izlobuotu Gatan K2 puornesšonys funkcejis augšejū Mo. RC-LH114-W datu kūpai itys suokūtnejais modeļs tyka puorveiduots, nūjamūt styprū bleivumu maskys moluos (atdaleits nu kūdula kompleksuo bleivuma UCSF Chimera). Dabuotūs modeļus (RC-LH114-W i RC-LH116 izškiertspieja ir attīceigi 3,91 i 4,16 Å) izmontoj kai atsauci 3D klasifikacejis ūtrajai kuortai. Izmontuotuos dalenis ir sagrupātys suokūtnejā 3D klasē i nasatur styprys korelacejis ar apleicīni. Puorsakluošona voi acimradzamu strukturalūs īzeimu tryukums. Piec ūtruos 3D klasifikacejis kuortys tyka izvālāta kategoreja ar vysleluokū izškiertspieju [RC-LH114-W vīna kategoreja ir 377 703 dalenis (44,5%), RC-LH116 ir tikai divejis kategorejis, kūpā 260 752 dalenis, kūpā 260 752 dalenis. piec suokūtnejuos rotacejis ar nalelu atškireibu]. Izlaseitys dalenis teik atkuortuoti izjimtys 400 pikseļu kastē i rafinātys ar 3D rafiniešonu. Škeidynuotuoja maska ​​teik izveiduota, izmontojūt suokūtnejū 15Å zamuos caurlaideibys filtru, 3 pikseļu kartis paplašynuošonu i 3 pikseļu meikstu masku. Izmontojūt CTF rafiniešonu iz daleņu, kusteibys korekceju iz daleņu i CTF rafiniešonys ūtrū kuortu, piec kotra sūļa teik veikta 3D rafiniešona, škeidynuotuoja maskuošona i piecapstruode, kab vēļ vaira rafinātu īgiutū teksturu. Izmontojūt FSC (Furjē apvalka korelacejis koeficienta) rūbežvierteibu 0,143, RC-LH114-W i RC-LH116 gola modeļu izškiertspieja ir attīceigi 2,65 i 2,80Å. Galeiguo modeļa FSC līkne paruodeita 2. attālā.S17.
Vysys ūlboltumvīlu sekveņcis teik lejupluodātys nu UniProtKB: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); 100 doc#1281 LH1-α (PufA; vīnprota ID: Q6N9L4); RC-L (PufL; vīnprota ID: O83005); RC-M (PufM; vīnprota ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; vīnprota ID: A0A4Z9); Ūlbaltumvīlys-W (PufW; vīnprota ID: Q6N1K3). SWISS-MODEL (45) tyka izmontuots, kab izveiduotu RC homologejis modeli, kas satur RC-L, RC-M i RC-H proteinu sekveņcis i Rba kristala strukturu. sferoidu RC tyka izmontuots kai veidne (PDB ID: 5LSE) (46). Izmontojit “pīmāruošonys kartis” reiku UCSF Himerā, kab pīlāguotu izveiduotū modeli kartei (47), uzlobuotu proteina strukturu, i kofaktoru [4×BChl a (monomeru bibliotekys atlykumu nūsaukums = BCL), 2×BPh a (BPH), vīns voi diveji veidi UQ10 (U10), vīns na-herons i vīns na-herons) . 3,4-dihidroheksakarbonilholins (QAK)] izmontoj Coot (48), lai pīvīnuotu. Tai kai QAK nav pīejams monomeru bibliotekā, tys tyka parametrizāts, izmontojūt eLBOW reiku PHENIX (49).
Piec tam tyka izveiduota LH1 apakšvīneiba. Suokumā automatiskū konstrukcejis reiku PHENIX (49) izmontuoja, kab automatiski konstruātu daļu LH1 sekveņcis, izmontojūt karti i LH1-α i LH1-β proteinu sekveņcis kai īvadi. Izlaseit piļneiguokū LH1 apakšvīneibu, izjimt i īkruot Coot, manuali pīvīnuot tymā tryukstūšū seceibu, i manuali precizēt vysu strukturu pyrma pīvīnuot divejus BCls a (BCL) i spiriloksantinu (CRT) [atbylstūši attīceigajim Rps LH1 kompleksa bleivums i zynomais karoteina saturs. Sugys (17)]. Kopej piļneigu LH1 apakšvīneibu, i izmontoj UCSF Chimera “Docking Map Tool”, kab pīsavīnuotu sūpluok asūšajā LH1 bleivuma namodeļa zonā, i tod precizātu tū Coot; atkuortuot procesu, cikom vysys LH1 apakšvīneibys ir modelātys. RC-LH114-W strukturai, izjamūt napīškiertū bleivumu Coot, proteins teik segmentāts nu atlykušūs naproteina komponentu USCF Chimera kartē, izmontoj Autobuild reiku, kab izveiduotu suokūtnejū modeli i atlykušūs apakšvīneibu (protein-W) modeliešonu. FENIKSĀ (49). Pīvīnoj sevkurys tryukstūšuos seceibys īgiutajam modeļam Coot (48) i tod manuali precizej vysu apakšvīneibu. Atlykušais napīškiertais bleivums atbylst lipidu kombinacejai (PDB monomeru bibliotekys ID CDL = CDL, POPC = 6PL i POPG = PGT), β-DDM mazgšonys leidzekļa (LMT) i UQ10 molekulu (U10). Izmontojit PHENIX optimizaceju (49) i manualū optimizaceju Coot (48), kab uzlobuotu piļneigu suokūtnejū modeli, cikom modeļa statistiku i pīguļeibys vizualū kvalitati navar vēļ vaira uzlobuot. Vysbeidzūt izmontojit LocScale (50), kab asynuotu vītejū karti, i piec tam veic vairuokus cytus napīškiertuo bleivuma modeliešonys cyklus i automatiskū i manualū optimizaceju.
Attīceigī peptidi, kofaktori i cyti lipidi i hinoni, kas pīvīnuoti sovā attīceigajā bleivumā, paruodeiti 1. i 2. attālā. S18 leidz S23. Galeiguo modeļa statistiskuo informaceja paruodeita S1 tabulā.
Ka nav nūruodeits cytaiži, UV/Vis/NIR absorbcejis spektri tyka apkūpuoti Cary60 spektrofotometrā (Agilent, ASV) ar 1 nm intervalu nu 250 nm leidz 1000 nm i integracejis laiku 0,1s.
Atšķaideit paraugu kvarca kivetē ar 2 mm ceļu leidz A880 nu 1, i savuokt absorbcejis spektru storp 400 i 1000 nm. Apļveida dihroiskī spektri tyka apkūpuoti Jasco 810 spektropolarimetrā (Jasco, Japana) ar 1 nm intervalu storp 400 nm i 950 nm ar skeniešonys uotrumu 20 nm min-1.
Molarū izmieršonys koeficientu nūsoka, atšķaidynojūt kūdula kompleksu leidz A880 apmāram 50. Atšķaidynoj 10 μl tylpumu 990 μl saistūšajā buferā voi metanolā i izreiz savuoc absorbcejis spektru, kab samazynuotu BChl nūsaškeļšonu. Kotrā metanola paraugā BChl saturu apriekinuoja ar izmieršonys koeficientu 771 nm 54,8 mM-1 cm-1, nūsaceja izmieršonys koeficientu (51). Izmiereitū BChl koncentraceju daleit ar 32 (RC-LH114-W) voi 36 (RC-LH116), kab nūsaceitu kūdula kompleksa koncentraceju, kū piec tam izmontoj, kab nūsaceitu tuo poša parauga absorbcejis spektru, kas savuokts buferā Izmieršonys koeficients. paralels. Kotram paraugam tyka veikti treis atkuortuoti mierejumi, apriekinam tyka izmontuota BChl Qy maksimuma videjuo absorbceja. RC-LH114-W izmieršonys koeficients, kū mierej 878 nm, ir 3280±140 mM-1 cm-1, tok RC-LH116 izmieršonys koeficients, kū mierej 880 nm, ir 3800±30 mM-1 cm-1.
UQ10 tyka kvantitativi nūsaceits piec metodis (52). Īsuokumā tyka veikta atgrīzeniskuos fazis HPLC (RP-HPLC), izmontojūt Agilent 1200 HPLC sistemu. Izšķīdynoj apmāram 0,02 nmol RC-LH116 voi RC-LH114-W 50μl 50:50 metanola:hloroforma, kas satur 0,02% (m/t) dzeļža hloridu, un īlīk īprīkš leidzsvoruotū Bekmana Koltera Ultrasferys m6 min-12. 40°C HPLC škeidynuotuojā (80:20 metanols:2-propanols) iz ×25 cm kolonys. Veic izokratiskū eluceju HPLC škeidynuotuojā, kab nūvāruotu absorbceju 275 nm (UQ10), 450 nm (karotinoidi) i 780 nm (BChl) 1 stuņdi. Tyka integrāts maksimums 275 nm hromatogramā 25,5 minotu laikā, kurā nabeja cytu nūsacejamu savīnuojumu. Integrātū laukumu izmontoj, kab apriekinuotu UQ10 molarū daudzumu, kas izjimts, atsasaucūt iz kalibracejis līkni, kas apriekinuota nu teiru standartu injekcejis nu 0 leidz 5,8 nmol (S14. att.). Kotrs paraugs tyka analizāts treis atkuortuojumūs, i ziņuotuo klaida atbylst videjam SD.
Šķīdums, kas satur RC-LH1 kompleksu ar maksimalū Qy absorbceju 0,1, tyka sagataveits ar 30 μM reducātu zyrga sirds citohromu c2 (Merck, Apvīnuotuo Karaliste) i 0 leidz 50 μMUQ2 (Merck, Apvīnuotuo Karaliste). Kotrā UQ2 koncentracejā sagataveja treis 1 ml paraugus i inkubēja nakti tymsā 4°C, kab pyrma mierejuma nūdrūsynuotu piļneigu pīsalāguošonu tymsai. Šķīdums tyka īkruots OLIS RSM1000 moduļu spektrofotometrā, kas aprīkots ar 300 nm līsmis/500 linejis režgi, 1,24 mm ītakys, 0,12 mm vyds i 0,6 mm iztakys spraugu. Parauga fotocaurulis i atsaucis fotoreizynuotuoja caurulis īejā teik īlykts 600 nm gars caurlaidis filtrs, kab izslāgtu īrūsynuošonys gaismu. Absorbceja tyka nūvāruota 550 nm ar integracejis laiku 0,15 s. Īrūsynuošonys gaisma teik izstaruota nu 880 nm M880F2 gaismys diodis (gaismys izstarojūšuo diode) (Thorlabs Ltd., Apvīnuotuo Karaliste) caur optiskū škīdru kabeli ar 90% intensitati caur DC2200 kontrolleri (Thorlabs Ltd., Apvīnuotuo Karaliste) i teik izstaruota iz gaismys olūta leņki 9°0. Miereišonys kūks ir pretrunā ar spīgeli, kab atgrīztu sevkuru gaismu, kū suokūtneji paraugs naabsorbēja. Uzraudzeit absorbceju 10 s pyrms 50 s apgaismuojuma. Piec tam absorbceja tyka tuoļuok nūvāruota 60 s tymsā, kab nūvārtātu, cik lelā mārā hinolols spontani samazynoj citohromu c23 + (izejdatim vērtīs S8 attālā).
Dati tyka apstruoduoti, pīlītojūt linearu suokuma uotrumu 0,5 leidz 10 s laikā (atkareibā nu UQ2 koncentracejis) i apriekinojūt vysu treju paraugu uotrumus kotrā UQ2 koncentracejā. RC-LH1 koncentraceju, kū apriekinuoja ar attīceigū pagaisšonys koeficientu, izmontuoja, kab puorveiduotu uotrumu katalitiskajā efektivitatē, kas attāluota Origin Pro 2019 (OriginLab, ASV) i pīlāguota Mihaela-Mentena modeļam, kab nūsaceitu škītamuos Km i Kcat vierteibys.
Pārejūšajim absorbcejis mierejumim RC-LH1 paraugu atšķaideja leidz ~2 μM IMAC buferā, kas satur 50 mM nātrejis askorbata (Merck, ASV) i 0,4 mM terbutinu (Merck, ASV). Askorbinskuobi izmontoj kai upura elektronu donoru, bet tert-butaklofenu izmontoj kai QB inhibitoru, kab nūdrūsynuotu, ka golvonais RC donors palīk reducāts (tys ir, na fotooksidāts) vysā mierejumu procesā. Apmāram 3 ml parauga pīvīnoj pīlāguotai rotejūšai šyunai (apmāram 0,1 m diametrā, 350 apgr./min.) ar 2 mm optiskuo ceļa garumu, kab nūdrūsynuotu, ka paraugam lazera ceļā ir pīteikūši daudz laika tymsai pīsalāguošonai storp īrūsynuošonys impulsim. Izmontoj ~100 fs lazera impulsus, kab pastyprynuotu Ti: Sapphire lazera sistemu (Spectra Physics, ASV), kab satrauktu paraugu 880 nm ar atkuortuošonys uotrumu 1 kHz (20 nJ NIR voi 100 nJ Vis). Pyrma datu vuokšonys paraugu apmāram 30 minotys pakļaun īrūsynuošonys gaismai. Īdarbeiba izraisīs QA inaktivizaceju (īspiejams, samazynojūt QA reizi voi divejis). Bet lyudzu, īvārojit, ka itys process ir atgrīzenisks, partū ka piec ilga tymsys adaptacejis perioda RC pamozom atsagrīzs pi QA darbeibys. Kab miereitu puorīmūšūs spektrus ar aizkaviešonuos laiku nu -10 leidz 7000 ps, ​​izmontuoja Helios spektrometru (Ultrafast Systems, ASV). Izmontojit Surface Xplorer programmu (Ultrafast Systems, ASV), kab atgrupātu datu kūpys, tod apvīnuotu i standartizātu. Izmontojit CarpetView programaturu (Light Conversion Ltd., Lītova), kab izmontuotu apvīnuotū datu kūpu, kab dabuotu ar sabrukšonu saisteitūs diferencialūs spektrus, voi izmontuotu funkceju, kas īkļaun vairuokus eksponentus ar instrumenta atbiļdi, kab atbylstu vīna viļņa garuma spektra evolucejai Origin (OriginLa).
Kai pīmynāts īprīkš (53), tyka sagataveita fotosintetiskuo plēve, kas satur LH1 kompleksu, kam tryukst gon RC, gon periferuos LH2 antenys. Membranu atšķaideja 20 mM tris (pH 8,0) i piec tam īkruove kvarca kivetē ar 2 mm optiskū ceļu. nJ lazera impulss tyka izmontuots, kab satrauktu paraugu 540 nm ar aizkaviešonuos laiku nu -10 leidz 7000 ps. Apstruoduot datu kūpu, kai apraksteits Rps. pal paraugs.
Membranu granulēja centrifugejūt 150 000 RCF 2 stuņdis 4°C, piec tam tuos absorbceja 880 nm atkuortuoti suspendēja 20 mM tris-HCl (pH 8,0) i 200 mM NaCl. Izšķīdynoj membranu, lānai maisūt 2% (m/t) β-DDM 1 stuņdi tymsā 4°C. Paraugu atšķaideja 100 mM trietilamonija karbonatā (pH 8,0) (TEAB; Merck, Apvīnuotuo Karaliste) leidz ūlboltumvīlu koncentracejai 2,5 mg ml-1 (Bio-Rad analize). Tuoļuokuo apstruode tyka veikta nu īprīkš publicātuos metodis (54), suocūt ar 50 μg proteina atšķaideišonu kūpā 50 μl TEAB, kas satur 1% (m/t) nātrejis lauratu (Merck, UK). Piec ultraskanis apstruodis 60 s tū samazynuoja ar 5 mM tris(2-karboksietil)fosfinu (Merck, Apvīnuotuo Karaliste) 37°C 30 minotys. S-alkiliešonai paraugu inkubej ar 10 mM metil S-metiltiometansulfonatu (Merck, UK) i pīvīnoj nu 200 mM izopropanola kruotuvis šķīduma 10 minotys ustobys temperaturā. Proteolitiskū gramuošonu veice, pīvīnojūt 2 μg tripsina/endoproteinazis Lys-C maisejuma (Promega UK) i inkubejūt 37°C 3 stuņdis. Lauratu virsmu aktivū vīlu ekstrahēja, pīvīnojūt 50 μl etilacetata i 10 μl 10% (t/t) LC pakuopis trifluoretiķskuobis (TFA; Thermo Fisher Scientific, Apvīnuotuo Karaliste) i vierpuļojūt 60 s. Fazu atdaleišonu veicynuoja centrifugaceja pi 15 700 RCF 5 minotys. Saskaņā ar ražuotuoja protokolu izmontuoja C18 grīzšonys kolonu (Thermo Fisher Scientific, Apvīnuotuo Karaliste), kab ryupeigi aspirātu i atsūļuotu apakšejū fazi, kas satur peptidu. Piec žāluošonys ar vakuuma centrifugaceju paraugu izškeide 0,5% TFA i 3% acetonitrilā, 500 ng analizēja ar nanoplyusmys RP hromatografeju kūpā ar masys spektrometreju, izmontojūt īprīšk detalizāti izkluosteitūs sistemys parametrus.
Izmontojit MaxQuant v.1.5.3.30 (56) ūlboltumvīlu identifikacejai i kvantitativai nūsaceišonai, kab meklētu Rps. 100 doc#1281 Pālustris proteomu datu bazis (v. Masys spektrometrejis proteomikys dati ir īlykti ProteomeExchange aliansē, izmontojūt PRIDE partneru kruotivi (http.
Analizei ar RPLC kūpā ar elektrosmiļkšu jonizacejis masys spektrometreju RC-LH1 komplekss tyka sagataveits nu sovvalis tipa Rps. Izmontojūt īprīkš publicātū metodi (16), palustris šyunuos ražuotuo proteina koncentraceja beja 2 mg ml-1 20 mM Hepes (pH 7,8), 100 mM NaCl i 0,03% (m/t) β- (Bio-Rad analize) ) DDM. Saskaņā ar ražuotuoja protokolu izmontoj 2D atteireišonys komplektu (GE Healthcare, ASV), kab ar nūgulumu metodi izjimtu 10 μg proteina, i izškeist nūgulumus 20 μl 60% (v / v) mudskuobis (FA), 20% (v / v) Acetonitrilā/ 20% iudinī. Pīcus mikrolitrus analizēja ar RPLC (Dionex RSLC) kūpā ar masys spektrometreju (Maksis UHR-TOF, Brukers). Izmontojit MabPac 1,2×100 mm kolonu (Thermo Fisher Scientific, Apvīnuotuo Karaliste) atdaleišonai 60°C i 100μlmin -1, ar gradientu 85% (v / v) škeidynuotuoja A [0,1% (v / v) škeidynuotuoja FA i 0,02% (v / v) škeidynuotuoja B8/v a [0,1%(v/v) FA i 0,02%(v/v) 90%(v/v) acetonitrila TFA] Izmontojūt standarta elektrosmiļkšu jonizacejis olūtu i nūklusātūs parametrus vaira kai 60 minotys, masys spektrometrs daboj 100 leidz 2750 m/z (masys i luodeņa attīceiba). Ar ExPASy bioinformatikys resursu portala FindPept rīka paleidzeibu kartēt masys spektru iz kompleksa apakšvīneibom.
Šyunys audzeja 72 stuņdis zam 100 ml NF zamys (10 μMm-2 s-1), videjis (30 μMm-2 s-1) voi augstys (300 μMm-2 s-1) gaismys. M22 bareiba (M22 bareiba, kurā izlaists amonija sulfats i aizstuots ar nātrejis sukcinatu) 100 ml skryuvis pudelē (23). Pīcūs 30 sekuņžu ciklūs 0,1 mikronu stykla krellis tyka krellis tylpuma attīceibā 1:1, kab lizētu šyunys i atdzesētu iz lada 5 minutis. Naškeidynojūšuos vīlys, nasalauztuos šyunys i stykla krellis tyka nūjimtys centrifugejūt 16 000 RCF 10 minotys golda mikrocentrifugā. Membrana tyka atdaleita Ti 70,1 rotorā ar 100 000 RCF 20 mM tris-HCl (pH 8,0) ar 40/15% (m/m) saharozis gradientu 10 stuņdis.
Kai apraksteits myusu īprīkšejā dorbā, His birkys imunodetekceja iz PufW (16). Eisuok sokūt, atteireitais kūdula komplekss (11,8 nM) voi membrana, kas satur taidu pošu RC koncentraceju (nūsoka oksidaceja, atjamūt samazynuotū atškireibu spektru i saskaņojūt slodzi iz īkruosuotuo gela) 2x SDS slodzeibys buferī (Merck, Apvīnuotuo Karaliste) atšķaidynuota divejis reizis. Ūlboltumvīlys tyka atdaleitys iz 12% bis-trisa NuPage gela (Thermo Fisher Scientific, Apvīnuotuo Karaliste). Gelu īkruosuoja ar Kumasi spylgtū zylu (Bio-Rad, Apvīnuotuo Karaliste), kab īluodeitu i vizualizātu RC-L apakšvīneibu. Ūlboltumvīlu iz ūtruo gela puornese iz metanola aktivizātū polivinilidena fluorida (PVDF) membranu (Thermo Fisher Scientific, Apvīnuotuo Karaliste) imunotesta veikšonai. PVDF membranu blokēja 50 mM tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 0,2% (t/t) Tween-20 i 5% (t/t) vāzpīna pulverī, piec tam inkubēja ar anti-His primarū antivīlu (buferā Atšķaideit mH0p 1:1000 A190-114A, Betila laboratorejis, ASV) 4 stuņdis. Piec 3 reizis mozguošonys antivīlu buferī 5 minotys, membranu apvīnuoja ar mārceņu peroksidazi (Sigma-Aldrich, UK) antipeļu sekundarū antivīlu (atšķaidynuota 1:10 000 antivīlu subferī) W Inkubej, lai ļautu nūsaceišonai (5 minotys piec 3 mozguošonys u antivīlu buferī EEST0). (Zianagens, Italeja) i Ameršama Imagers 600 (GE Veseleibys apryupe, Apvīnuotuo Karaliste).
Izzeimejūt kotra īkruosuotuo gela voi imunotesta jūslys intensitatis sadalejumu, integrejūt laukumu zam viersyunis i apriekinojūt RC-L (īkruosuotuo gela) i Protein-W (imunotesta) intensitatis attīceibu, ImageJ (57) Apstruodoj attālu. Ituos attīceibys tyka puorveiduotys par molarom attīceibom, pījamūt, ka RC-L pret proteina-W attīceiba teirajā RC-LH114-W paraugā beja 1:1 i attīceigi normalizejūt vysu datu kūpu.
Papyldu materialus itamā rokstā var atrast sātyslopā.
Tys ir atkluotys pīkļuvis roksts, kas izplateits saskaņā ar Creative Commons attīcynuošonys licences nūsacejumim. Roksts atļaun naīrūbežuoti lītuot, izplateit i reproducēt sevkurā medejā ar nūsacejumu, ka originaldorbs ir pareizi citāts.
Pīzeime: Mes tikai lyudzam nūruodeit sovu e-posta adresu, lai cylvāks, kuru īsaceisi lopai, zynuotu, ka gribit, lai jis redz e-postu i ka tys nav spams. Mes naīgiusim nikaidys e-posta adresis.
Itys vaicuojums teik izmontuots, kab puorbaudeitu, voi esi apmaklātuojs i nūvārstu automatisku spama īsnīgšonu.
Deivids Dž. K. Sveinsberijs, Parks Cjans, Filips Dž. Džeksons, Keitlina M. Farija, Dariušs M. Nīdvidzki, Elizabete K. Mārtina, Deivids A. Farmers, Lorna A. Malona, ​​Rebeka F. Tompsona, Nīls A. Ransons, Daniels P. Kanifs, Marks Dž.
Gaismys slazdu 1 kompleksa augstys izškiertspiejis struktura reakcejis centrā snādz jaunus īskotus hinonu dinamikā.
Deivids Dž. K. Sveinsberijs, Parks Cjans, Filips Dž. Džeksons, Keitlina M. Farija, Dariušs M. Nīdvidzki, Elizabete K. Mārtina, Deivids A. Farmers, Lorna A. Malona, ​​Rebeka F. Tompsona, Nīls A. Ransons, Daniels P. Kanifs, Marks Dž.
Gaismys slazdu 1 kompleksa augstys izškiertspiejis struktura reakcejis centrā snādz jaunus īskotus hinonu dinamikā.
©2021 Amerikys Zynuotnis atteisteibys asociaceja. vysys tīseibys aizsorguotys. AAAS ir HINARI, AGORA, OARE, KORA, STUDŅUSS, KrystRef i SKAITEITUOJA partneris. Zynuotnis sasnāgumi ISSN 2375-2548.