Tagadne *Pošreizejuo adrese: Keļne 50931, Vuoceja, Keļne izcileibu kūpys pietejumi par šyunu stresa reakceju ar nūvacuošonu saisteituos slimeibuos (CECAD).
Mitohondreju slimeibu neirodegeneraceja teik skaiteita par naatgrīzenisku, partū ka neironu vīlmainis plastiskums ir īrūbežuots, tok mitohondreju disfunkcejis ītekme iz neironu vīlmainis šyunu autonomeju organismā ir švaki saprosta. Ite mes īpazeistynojam ar šyunom specifiskū Purkinjis neironu proteomu ar progresivu OXPHOS tryukumu, kū izraisa izjauktuo mitohondreju saplyusšonys dinamika. Mes atkluojom, ka mitohondreju disfunkceja izraiseja dzilis puormainis proteomikys jūmā, kas gols golā nūvede pi precizu vīlmainis programu seceigys aktivizacejis pyrma šyunu nuovis. Nagaideiti nūsacejom acimradzamu piruvata karboksilazis (PCx) i cytu peroksidažu indukceju, kas saisteita ar TCA cykla starpproduktu papyldynuošonu. PCx nūmīriešona saasynuoja oksidativū stresu i neirodegeneraceju, kas nūruoda, ka aterosklerozei ir aizsorgojūša īdarbeiba neirōnūs, kurim tryukst OXPHOS. Mitohondreju saplyusšonys atjaunuošona galeigi degenerātūs neirōnūs piļneibā maina ituos vīlmainis eipašeibys, taidā veidā nūvieršūt šyunu nuovi. Myusu atkluojumi identificej īprīkš nazynomus ceļus, kas nūdrūsynoj iztureibu pret mitohondreju disfunkceju i paruoda, ka neirodegeneraceju var maineit ari slimeibys vālajā stadejā.
Mitohondreju golvonū lūmu neironu energejis metabolisma uzturiešonā pastreipoj plašī neirologiskī simptomi, kas saisteiti ar cylvāka mitohondreju slimeibom. Leluokū daļu itūs slimeibu izraisa genu mutacejis, kas regulej mitohondreju genu ekspreseju (1, 2) voi genu iznycynuošona, kas saisteita ar mitohondreju dinamiku, kas natīši ītekmej mitohondreju DNS (mtDNS) stabilitati (3, 4). Dorbs dzeivinīku modeļūs ir paruodejs, ka, reagejūt iz mitohondreju disfunkceju apleicejūs audūs, var aktivizēt konservativūs vīlmainis ceļus (5-7), taidā veidā snādzūt svareigu īskotu itūs sarežgeitūs slimeibu patogenezē. Preteji myusu izpratnei par konkretu šyunu veidu vīlmainis izmaiņom, kū izraisa smedziņu mitohondreju adenozintrifosfata (ATP) ražuošonys vyspuorejuo naveiksme, ir byutiska (8), pastreipojūt napīcīšameibu identificēt terapeitiskūs mierķus, kū var izmontuot slimeibu nūviersšonai voi nūviersšonai. Nūvērst neirodegeneraceju (9). Informacejis tryukums ir fakts, ka nervu šyunom teik plaši skaiteits par cīši īrūbežuotu vīlmainis elasteibu, saleidzynojūt ar apleicejūs audu šyunu veidim (10). Jamūt vārā, ka itom šyunom ir golvonuo lūma metabolitu pīguodis koordiniešonā neironim, kab veicynuotu sinaptisku puornesšonu i reagātu iz traumu i slimeibu apstuoklim, spieja pīlāguot šyunu metabolismu smedziņu audu izaicynuojumim ir gondreiž īrūbežuota leidz glialajom šyunom (11-14). Pi tam smedziņu audu šyunu navīndabeigums lelā mārā traucej izpieteit vīlmainis izmainis, kas nūteik nūteiktuos neironu apakšgrupuos. Rezultatā ir moz zynoms par precizom mitohondreju disfunkcejis šyunu i vīlmainis sakom neirōnūs.
Kab saprostu mitohondreju disfunkcejis vīlmainis sekys, mes izolējom Purkinjis neironus (PN) dažaidūs neirodegeneracejis pūsmūs, kū izraisa mitohondreju uorejuos membranys saplyusšonys (Mfn2) iznycynuošona. Koč i Mfn2 mutacejis cylvākā ir saisteitys ar īdzymtu motoriskuos sensoruos neiropatejis veidu, kas pazeistama kai Šarko-Mari-Zūba 2A tips (15), Mfn2 nūsaceituo iznycynuošona pelei ir labi atzeita oksidacejis fosforolizis (OXthoPHOS) disfunkcejis indukceja. Dažaidim neironu apakštipim (16-19) i īgiutajam neirodegenerativajim fenotipim ir leidza progresejūši neirologiski simptomi, par pīmāru, kusteibu trauciejumi (18, 19) voi smedziņu atakseja (16). Izmontojūt bezmarku kvantitativuos (LFQ) proteomikys, metabolomikys, attāluošonys i virologiskuos metožu kombinaceju, mes paruodom, ka progresiva neirodegeneraceja spieceigi izraisa piruvata karboksilazi (PCx) i cytus faktorus, kas īsaisteiti PN arteriosklerozē in vivo Enzimu ekspreseja. Kab puorbaudeitu ituo atkluojuma nūzeimi, mes eipaši samazynuojom PCx ekspreseju Mfn2 tryukuma PN i atkluojom, ka itei darbeiba saasynuoja oksidativū stresu i pauotrynuoja neirodegeneraceju, taidā veidā pīruodūt, ka azoospermeja nūdrūsynoj šyunu nuovi Metaboliskū pīsalāguošonu. Smoga MFN2 ekspresija var piļneibā izgluobt terminalū degeneracejis PN ar smogu OXPHOS tryukumu, masveida mitohondreju DNS patiereņu i acimradzūt salauztu mitohondreju teiklu, kas vēļ vaira pastreipoj, ka itei neirodegeneracejis forma var pat atsaveseļuot pyrma slimeibys progresejūšā šyunu stadejā.
Kab vizualizātu mitohondrejus Mfn2 nokautu PN, mes izmontuojom peļu calmu, kas ļaun nu Cre atkareigim mitohondrejim mierķauditorejis nūvierzeit iz dzaltonuo fluoresciejušuo proteina (YFP) (mtYFP) (20) Cre ekspreseju i puorbaudejom mitohondreju morfologeju in vivo. Mes atkluojom, ka Mfn2 gena iznycynuošona PN nūvastu pi pakuopeniskys mitohondreju teikla sasadaleišonys (S1A attāls), i agruokuos izmainis tyka konstatātys 3 nedeļu vacumā. Sovukuort PN šyunu sluoņa byutiskuo degeneraceja, par kū līcynoj Kalbindina imunoīkruosuošonys zaudiešona, suocēs leidz 12 nedeļu vacumam (1. att., A i B). Laika nasaskaņa storp agruokom izmaiņom mitohondreju morfologejā i radzamū neironu nuovis suokumu pamudynuoja izpieteit vīlmainis izmainis, kū izraisa mitohondreju disfunkceja pyrma šyunu nuovis. Mes izstruoduojom iz fluoresciešonys aktivizātu šyunu sakuortuošonys (FACS) baļsteitu strategeju, kab izolātu YFP (YFP +) ekspresejūšū PN (1. att. C), i kontrolis peleitēs (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), kas turpmuok sauktu par CT1BRL (att. C). 100 doc#1281 Vārtu strategejis optimizaceja, kas baļsteita iz YFP signala relativū intensitati, ļaun mums atteireit PN YFP+ kermini (YFPhigh) nu na-PN (YFPneg) (S1B attāls) voi īspiejamim fluoresciejūšajim aksonu / dendritiskūs fragmentim (YFPlow; S1D attāls apstyprynuots ar S1D attālu, pa kreisi). Kab puorbaudeitu klasificātuos populacejis identitati, mes veicem LFQ proteomiku i piec tam golvonūs komponentu analizi, i atkluojom, ka ir skaidra atdaleišona storp YFPhigh i YFPneg šyunom (S1C attāls). YFPhigh šyunuos beja zynomūs PNs markeru (t.i., Calb1, Pcp2, Grid2 i Itpr3) teira boguotynuošona (21, 22), bet nikaida proteinu boguotynuošona, kas parosti izapauž neirōnūs voi cytūs šyunu tipūs (1D att.) ). Saleidzynuojums storp paraugim klasificātuos YFPhigh šyunuos, kas savuoktys naatkareigūs eksperimentūs, paruodeja korelacejis koeficientu> 0, 9, paruodūt lobu reproduciejameibu storp biologiskajim atkuortuojumim (S1E attāls). Kūpsavylkumā itī dati apstyprynuoja myusu planu par īspiejamūs PN akutū i specifisku izolaceju. Tai kai izmontuotuo L7-cre vadeituoja sistema izraisa mozaikys rekombinaceju pyrmajā nedeļā piec dzemdeibu (23), mes suocem izkaļt pelis nu CTRL i nūsaceitu (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) Savuokt neironus. Piec rekombinacejis pabeigšonys tū sauc par Mfn2cKO 4 nedeļu vacumā. Kai beigu punktu izavieliejom 8 nedeļu vacumu, kod PN sluoņs vēļ beja naskorts, nasaverūt iz acimradzamajim mitohondreju fragmentim (1. att. B i S1. att.). Kūpumā mes kvantitativi nūviertējom kūpā 3013 proteinus, nu kurūs apmāram 22% beja baļsteitys iz MitoCarta 2.0 anotacejom, kas baļsteitys iz mitohondreju proteomu kai mitohondrejim (1. att. E) (1. att. E) (24). nedeļā veiktuo diferenciāluo genu ekspresejis analize paruodeja, ka tikai 10,5% vysu proteinu beja nūzeimeigys izmainis (1. att. F i S1. att. S1F), nu kurūs 195 proteini tyka regulāti iz leju i 120 proteini tyka regulāti iz augšu (1. att. F). Ir vārts pīzeimēt, ka ituos datu kūpys “inovativuo ceļa analize” paruoda, ka diferenciāti ekspresātī geni golvonūkuort pīdar īrūbežuotam specifisku vīlmainis ceļu kūpai (1. att. G). Interesanti, ka koč i ar OXPHOS i kalceja signaliziešonu saisteitūs ceļu lejupsleidi apstyprynoj mitohondreju disfunkcejis izraiseišonūs saplyusšonys tryukuma PN, cytys kategorejis, kas golvonūkuort īsaista aminoskuobu metabolismu, ir īvārojami augšuok regulātys, kas atbylst mitodriju P metabolismam. Pōrvade ir konsekventa. disfunkceja.
(A) CTRL i Mfn2cKO peļu smedziņu sekceju reprezentativys konfokaluos fotografejis, kas paruoda progresivu PN zaudiešonu (kalbindins, pelēks); kūduli tyka pretkruosuoti ar DAPI. (B) (A) kvantitativa nūsaceišona (vīnvierzīņa dispersejis analize, *** P <0, 001; n = 4 leidz 6 apli nu treju peleišu). (C) Eksperimentaluo dorba plyusma. (D) Purkinjei rakstureigūs markeru syltuma kartis sadalejums (augšā) i cytim šyunu veidim (vydā). (E) Vena diagrama, kas paruoda klasificātajā PN identificātūs mitohondreju proteinu skaitu. (F) Diferenciāti ekspresātūs proteinu vulkana laukums Mfn2cKO neirōnūs 8 nedeļu laikā (nūzeimeiguma rūbežvierteiba 1,3). (G) Rodūšuma ceļa analize paruoda pīcus svareiguokūs augšupreguliešonys (sorkons) i lejupreguliešonys (zyls) ceļus Mfn2cKO PN, kas klasificāts kai 8 nedelis. Paruodeits kotra atkluotuo proteina videjais ekspresejis leimiņs. Pelēkūs tūņu syltuma karte: pīlāguota P vierteiba. ns, nav svareigi.
Proteomikys dati paruodeja, ka kompleksu I, III i IV proteina ekspreseja pamozom sasamazynuoja. I, III i IV kompleksūs vysūs beja byutiskys mtDNS kodātys apakšvīneibys, bet II kompleksā, kas beja tikai kūdulkodāts, pamatā nabeja ītekmāts (2. att. A i S2. att. S). . Atbylstūši proteomikys rezultatim, smedziņu audu sekceju imunohistokimeja paruodeja, ka MTCO1 (mitohondreju citohroma C oksidazis apakšvīneiba 1) kompleksa IV apakšvīneibys leimiņs PN pamozom sasamazynuoja (2. att. B). mtDNS kodātuo apakšvīneiba Mtatp8 tyka īvārojami samazynuota (S2A attāls), bet kūdulkodātuos ATP sintazis apakšvīneibys leidzsvora stuovūkļa leimiņs palyka namaineigs, kas atbylst zynomajam stabilajam ATP sintazis apakšmontažys F1 kompleksam, kod mtDNS ekspreseja ir stabila. Veiduojums ir konsekvents. Pārtraukt (7). mtDNS leimiņa nūviertiejums sakuortuotajūs Mfn2cKO PN ar realajā laikā polimerazis kēdis reakceju (qPCR) apstyprynuoja pakuopenisku mtDNS kopeju skaita sasamazynuošonu. Saleidzynojūt ar kontrolis grupu, 8 nedeļu vacumā tyka saglobuoti tikai apmāram 20% mtDNS leimiņa (2. att. C). Atbylstūši itim rezultatim, Mfn2cKO PN konfokaluos mikroskopejis kruosuošona DNS nūsaceišonai paruoda nu laika atkareigu mitohondreju nukleotidu patiereņu (2D att.). Mes atkluojom, ka tik daži kandidati, kas īsaisteiti mitohondreju proteinu nūsaškeļšonā i stresa reakcejā, tyka regulāti, tymā skaitā Lonp1, Afg3l2 i Clpx i OXPHOS kompleksī montažys faktori. Natyka konstatātys byutiskys izmainis apoptozē īsaisteitūs proteinu leiminī (S2B attāls). Leidzeigi mes atkluojom, ka kalceja transportā īsaisteitajim mitohondrejim i endoplazmys teikla kanalim ir tikai nalelys izmainis (S2C att.). Pi tam ar autofageju saisteitūs proteinu nūviertiejumā natyka konstatātys nūzeimeigys izmainis, kas atbylst radzamajai autofagosomu indukcejai, kū nūvāroj in vivo ar imunohistokimeju i elektronu mikroskopeju (S3 attāls). Tok progresejūšū OXPHOS disfunkceju PN pavoda acimradzamys ultrastrukturalys mitohondreju izmainis. Mitohondreju kūpys var redzēt Mfn2cKO PN šyunu kerminūs i dendritiskajūs kūkūs 5 i 8 nedeļu vacumā, i īkšejuos membranys struktura ir pīdzeivuojuse dzilis izmainis (S4, A i B att.). Atbylstūši itom ultrastrukturalajom izmaiņom i īvārojamam mtDNS sasamazynuošonai, akutu smedziņu smedziņu škēļu analize ar tetrametilrodamina metilesteru (TMRM) paruodeja, ka mitohondreju membranys potencials Mfn2cKO PN beja īvārojami sasamazynuojs (S4C attāls).
(A) OXPHOS kompleksa izteiksmis leimiņa laika gaita analize. Apsver tikai proteinus ar P<0, 05 8 nedeļuos (divvierzīņa ANOVA). Punktāta lineja: Nav pīlāguošonys saleidzynuojumā ar CTRL. (B) Pa kreisi: smedziņu sekcejis pīmārs, kas markiets ar anti-MTCO1 antivīlu (mārūga josla, 20 μm). Purkinjis šyunu kermeņu aizjimtū plateibu apkluoj dzaltons. Pa labi: MTCO1 leimiņa kvantitativa nūsaceišona (vīnvierzīņa dispersejis analize; n = 7 leidz 20 šyunys, kas analizātys nu treju peleišu). (C) mtDNS kopeju skaita qPCR analize sakuortuotajā PN (vīnvierzīņa dispersejis analize; n = 3 leidz 7 pelis). (D) Pa kreisi: smedziņu škēlis pīmārs, kas markiets ar anti-DNS antivīlu (mārūga josla, 20 μm). Purkinjis šyunu kermeņu aizjimtū plateibu apkluoj dzaltons. Pa labi: mtDNS bojājumu kvantitativa nūsaceišona (vīnvierzīņa dispersejis analize; n = 5 leidz 9 šyunys nu treju peļu). (E) Akutys smedziņu sekcejis pīmārs, kurā radzamys mitoYFP + Purkinje šyunys (bulteņa) vasalu šyunu plākstera spailis īrokstā. (F) IV līknis kvantitativais nūsacejums. (G) Reprezentativi īroksti par depolarizejūšuos strāvys injekceju CTRL i Mfn2cKO Purkinjis šyunuos. Augšejais pāds: Pyrmais impulss, kas izraiseja AP. Apakšejais pāds: Maksimalais AP bīžums. (H) Postsinaptiskūs spontanūs īvažu (sPSP) kvantitativa nūsaceišona. Reprezentativais īroksta pāds i tuo tāluojuma attīceiba paruodeita (I). Vīnvierzīņa dispersejis analize analizēja n = 5 leidz 20 šyunys nu treju peļu. Dati izsaceiti kai videjais±SEM; * P <0, 05; **P <0, 01; ***P <0, 001. (J) Reprezentativi spontanuo AP pādi, kas īraksteiti, izmontojūt perforātuo plākstera spailis režimu. Augšejais pāds: Maksimalais AP bīžums. Apakšejais pāds: vīna AP tāluojums. (K) Kvantitativi nūsaceit videjū i maksimalū AP bīžumu saskaņā ar (J). Mana-Vitnija tests; n = 5 šyunys tyka analizātys nu četru peleišu. Dati izsaceiti kai videjais±SEM; nav svareigi.
nedeļu vacajā Mfn2cKO PN tyka konstateiti acimradzami OXPHOS bojājumi, kas nūruoda, ka neironu fiziologiskuo funkceja ir stypri naparosta. Deļtuo mes analizējom OXPHOS tryukuma neironu pasivuos elektriskuos eipašeibys 4–5 nedeļuos i 7–8 nedeļuos, veicūt vasalu šyunu plāksteru spaiļu īrokstus akutuos smedziņu škēlēs (2. att. E). Nagaideiti Mfn2cKO neironu videjais atpyutys membranys potencials i īvadis rezistence beja leidzeiga kontrolei, koč i storp šyunom beja smolkys atškireibys (1. tabula). Taipat 4 leidz 5 nedeļu vacumā natyka konstateitys byutiskys izmainis strāvys i sprīguma attīceibuos (IV līkne) (2. att. F). Tok nivīns nu 7–8 nedeļu vacs Mfn2cKO neirons naizdzeivuoja piec IV režima (hiperpolarizacejis sūļs), kas nūruoda, ka itymā vālajā pūsmā ir skaidra jiuteiba pret hiperpolarizacejis potencialu. Sovukuort Mfn2cKO neirōnūs depolarizejūšuos struovys, kas izraisa atkuortuotu darbeibys potenciala (AP) izplyudis, ir labi paneisamys, kas nūruoda, ka tūs kūpejī izplyudis modeli byutiski naatškir nu 8 nedeļu vacu kontrolis neironu (1. tabula i 2. att. G). Leidzeigi ari spontanūs postsinaptiskūs strāvu (sPSC) bīžums i amplituda beja saleidzynojams ar kontrolis grupys bīžumu, i nūtykumu bīžums pīauga nu 4 nedeļu leidz 5 nedeļom leidz 7 nedeļom leidz 8 nedeļom ar leidzeigu pīaugumu (2. att., H i I). Sinaptiskuos nūbrīduma periods PN (25). Leidzeigi rezultati tyka īgiuti ari piec perforātu PNs plāksteru. Itei konfiguraceja nūvierš īspiejamu šyunu ATP defektu kompensaceju, kai tys varātu nūtikt vysu šyunu plāksteru spaiļu īraksteišonā. Eipaši Mfn2cKO neironu atpyutys membranys potencials i spontanuos šaušonys bīžums natyka ītekmāts (2. att., J i K). Kūpsavylkumā itī rezultati nūruoda, ka PN ar acimradzamu OXPHOS disfunkceju var labi tikt golā ar augstfrekveņču izlādis modelim, nūruodūt, ka ir kompensacejis mehanisms, kas ļaun jim uzturēt gondreiž normalys elektrofiziologiskuos reakcejis.
Dati izsaceiti kai videjais ± SEM (vīnvierzīņa dispersejis analize, Holma-Sidaka daudzkuortejuo saleidzynuojuma tests; * P<0, 05). Vienības numurs ir nūruodeits īkovuos.
Mes izvierzejom izpieteit, voi kaida kategoreja proteomikys datu kūpā (1. att. G) īkļaun ceļus, kas var nūvērst smogu OXPHOS tryukumu, taidā veidā izskaidrojūt, parkū ītekmātais PN var uzturēt gondreiž normalu elektrofiziologeju (2. att., E leidz K). . Proteomikys analize paruodeja, ka enzimi, kas īsaisteiti sazaruotuos kēdis aminoskuobu (BCAA) katabolismā, tyka īvārojami augšuok regulāti (3. att. A i S5. att.), i gola produkts acetil-CoA (CoA) voi sukcinil CoA var papyldynuot trikarboksilatus arteriosklerozē (arteriosklerozē). Mes konstatējom, ka BCAA transaminazis 1 (BCAT1) i BCAT2 saturs gon pīauga. Jī katalizēja pyrmū BCAA katabolisma sūli, radeidams glutamātu nu α-ketoglutarata (26). Vysys apakšvīneibys, kas veidoj sazaruotuos kēdis ketoskuobis dehidrogenazis (BCKD) kompleksu, teik regulātys (komplekss katalizej īgiutuo BCAA ūglekļa skeleta turpmuokū i naatgrīzeniskū dekarboksiliešonu) (3. att. A i S5. att. A). Tok sakuortuotajā PN natyka konstateitys acimradzamys izmainis pošā BCAA, kas var byut saisteitys ar palelynuotu itūs napīcīšamūs aminoskuobu uzjimšonu šyunuos voi cytu olūtu (glikozis voi pīnskuobis) izmontuošonu, kab papyldynuotu TCA cyklu (S5B attāls). PN, kurim tryukst OXPHOS, ari 8 nedeļu vacumā beja palelynuota glutamina sadaleišonys i transaminacejis aktivitate, kū var atspīgeļuot mitohondreju enzimu glutaminazis (GLS) i glutamina piruvata transaminazis 2 (GPT2) augšupejūšuo reguliešona (3. att., A i C). Ir vārts pīzeimēt, ka GLS augšupejūšuo reguliešona ir īrūbežuota ar savīnuotū izoformu glutaminazis C (GLS-GAC) (Mfn2cKO/CTRL izmainis ir apmāram 4,5 reizis leluokys, P = 0,05), i tuo specifiskuo augšupejūšuo reguliešona vieža auduos var atbaļsteit mitonergiondreju. (27).
(A) Syltuma kartē radzamys proteina leimiņa reiku izmainis nūruodeitam maršrutam 8 nedeļuos. (B) Smedziņu škēlis pīmārs, kas markiets ar anti-PCx antivīlu (mārūga stīplis, 20 μm). Dzaltonuo bulteņa nūruoda iz Purkinjis šyunu kermini. (C) Laika gaita proteina ekspresejis analize, kas konstatāta kai svareigs aterosklerozis kandidats (vairuokkuorteigs t-tests, * FDR <5%; n = 3-5 pelis). (D) Augšuok: shematiska diagrama, kas paruoda dažaidus veidus, kai īīt markietū ūglekļa, kas atsarūn [1-13C] piruvata markietuojā (t.i., caur PDH voi transarterialū ceļu). Apakšā: vijūlis diagramā radzams vīn markietuo ūglekļa (M1) procents, kas puorsavierš par aspartskuobi, cytronskuobi i ōbeļskuobi piec akutu smedziņu škēļu markiešonys ar [1-13C]piruvatu (puorī t-tests; ** P <0, 01). (E) Nūruodeituo ceļa vysaptverūša laika viesturis analize. Apsverit tikai proteinus ar P<0,05 8 nedeļuos. Svītruota lineja: nav korekcejis vierteibys (divvierzīņa dispersejis analize; * P <0, 05; *** P <0, 001). Dati izsaceiti kai videjais±SEM.
Myusu analizē BCAA katabolisms ir palics par vīnu nu golvonūs augšupejūšuos reguliešonys ceļu. Itys fakts styngri līcynoj, ka ventilacejis tylpums, kas īīt TCA cyklā, var tikt maineits PN, kam tryukst OXPHOS. Tys var byut golvonais neironu vīlmainis puorvaduošonys veids, kas var tīši ītekmēt neironu fiziologeju i izdzeivuošonu smogys OXPHOS disfunkcejis uzturiešonys laikā. Atbylstūši itai hipotezei, mes atkluojom, ka golvonais preaterosklerotiskais enzims PCx ir augšuok regulāts (Mfn2cKO/CTRL mainuos apmāram 1,5 reizis; 3. att. A), kas katalizej piruvata puorviersšonu par oksaloacetatu (28), kas, dūmojams, ir audu ekspresijā a2. 30). Atbylstūši proteomikys rezultatim konfokaluo mikroskopeja paruodeja, ka PCx ekspresija beja specifiski i īvārojami palelynuota OXPHOS tryukuma PN, bet PCx reaktivitate golvonūkuort beja īrūbežuota sūpluok asūšajom Bergmana glialuom kontrolis šyunom (3. att. B). Kab funkcionali puorbaudeitu nūvāruotū PCx augšupejūšū reguliešonu, mes apstruoduojom akutys smedziņu škēlis ar [1-13C] piruvata markieri. Kod piruvatu oksidēja piruvata dehidrogenaze (PDH), tuo izotopu markiejums pazuda , Bet teik īkļauts TCA cykla storpproduktūs, kod piruvatu metabolizej ar vaskularom reakcejom (3D att.). Atbolstūt myusu proteomikys datus, mes nūvāruojom lelu skaitu markeru nu ituo markieru Mfn2cKO škēļu aspartatskuobē, bet ari cytronskuobei i ōbeļskuobei beja videja tendeņce, koč i na nūzeimeiga (3D att.).
MitoPark peļu dopamina neirōnūs ar mitohondreju disfunkceju, kū izraisa dopamina neironi, kas eipaši iznycynoj mitohondreju transkripcejis faktora A genu (Tfam) (S6B attāls), PCx ekspresija ari tyka īvārojami regulāta augšuok (31), kas nūruoda, ka acetonskuobis arteriosklerozis disfunkceja ir OKSFOS organismā. 100 doc#1281 Ir vārts pīzeimēt, ka ir konstatāts, ka unikali enzimi (32-34), kas var izapaust neirōnūs, kas var byut saisteiti ar arteriosklerozi, ir īvārojami augšuok regulāti PN, kurim tryukst OXPHOS, par pīmāru, propionil-CoA karboksilaze (PCC-A), Malonil-CoA mitrilikona-propionil-CoA puorvierš propionil-CoA-ma-CoA. enzims (ME3), kura golvonuo lūma ir piruvata atgiušona nu malata (3. att., A un C) (33, 35). Bez tuo, mes konstatējom īvārojamu Pdk3 enzima pīaugumu, kas fosforilej i taidā veidā inaktivizej PDH (36), bet Pdp1 enzimā, kas aktivizej PDH, voi pošā PDH enzimu kompleksā, natyka konstateitys izmainis (3. att. A). Konsekventi Mern2cKO PN tyka uzlobuota PDH kompleksa piruvata dehidrogenazis E1 komponenta α1 apakšvīneibys α (PDHE1α) apakšvīneibys fosforoliešona Ser293 (zynoms, ka PDH enzimu aktivitatis nūmīrynoj) (S6C attāls) (S6C attāls). Piruvatam nav vaskularuos pīkļuvis.
Vysbeidzūt, mes atkluojom, ka serina i glicina biosintezis superceļš, ar tū saisteitais mitohondreju folātu (1C) cykls i prolina biosinteze (1.G att. i S5C att.) vysi ir īvārojami augšuok regulāti, saskaņā ar ziņuojumim, aktivacejis procesa laikā. Apleicejī audi teik aktivizāti ar mitohondreju disfunkceju (5-7). Konfokaluo analize, kas atbolsta itūs proteomikys datus, paruodeja, ka PN, kurā tryukst OXPHOS, 8 nedeļu vacu peļu smedziņu škēlis tyka pakļautys serina hidroksimetiltransferazei 2 (SHMT2), golvonajam mitohondreju folatu cykla enzimam. Nūzeimeiga imunreakceja (S5D attāls). CU-glikozis inkubātuos akutuos smedziņu škēlēs vīlmainis izsekuošonys eksperimenti vēļ vaira apstyprynuoja serina i prolina biosintezis reguliešonu, kas nūruoda, ka pasalelynuoja ūglekļa izoformu plyusma serinā i prolinā (S5E attāls). Tai kai GLS i GPT2 veicynuotuos reakcejis ir atbiļdeigys par glutamata sintezi nu glutamina i transaminaceju storp glutamata i α-ketoglutaratu, tūs augšupejūšuo reguliešona nūruoda, ka OXPHOS tryukuma neironi ir palelynuots pīprasejums piec glutamata , Tys var byut vārsts iz palelynuotuos prourelina biosintezis uzturiešonu (Att.5). Atškireibā nu itūs izmaiņu PN specifiskūs Mfn2cKO peļu smedziņu astrocitu proteomiskuo analize paruodeja, ka itī celi (tymā skaitā vysys antiperoksidazis) byutiski nasamaineja ekspresijā, taidā veidā paruodūt, ka Itys vīlmainis puorvierzejums ir selektivs pret degradātū PN iz D (S6 att., G).
Kūpsavylkumā ituos analizis atkluoja īvārojami atškireigus konkretu vīlmainis ceļu laika aktivacejis modeļus PN. Koč i naparosta neironu mitohondreju funkceja var izraiseit agru aterosklerozi i 1C puorveiduošonu (3. att. E i S5. att.), i pat paradzamys izmainis I i IV kompleksu ekspresijā, izmainis serina de novo sintezē ir tikai Tys palyka radzams tikai vālajā stadejā. OXPHOS disfunkceja (3. att. E i S5. att.). Itī atkluojumi nūsoka seceigu procesu, kurā stresa izraiseituo mitohondreju (1C cikls) i citoplazmys (serina biosinteze) reagej sinergiski ar aterosklerozis pīaugumu TCA cyklā, kab puorveiduotu neironu metabolismu.
nedelis vaci OXPHOS tryukuma PN var uzturēt augstfrekveņču īrūsynuošonys aktivitati i pīdzeivuot nūzeimeigu vīlmainis atjaunuošonu, kab kompensātu mitohondreju disfunkceju. Itys atkluojums roda interesantu īspieju, ka ari itymā breidī ituos šyunys var ari sajimt terapeitisku īsajaukšonu, kab aizkavātu voi nūvārstu neirodegeneraceju. Vāls. Itū īspieju mes atrysynuojom ar divejom naatkareigom īsajaukšonom. Pyrmajā metodē mes izstruoduojom nu Cre atkareigu ar adeno asociātu virusu (AAV) vektoru, lai MFN2 varātu selektivi izsaceit OXPHOS deficita PN in vivo (S7A attāls). AAV, kas kodej MFN2, i fluoresciejūšais reportera gens mCherry (Mfn2-AAV) tyka puorbaudeiti primarajuos neironu kulturuos in vitro, kas izraiseja MFN2 ekspreseju nu Cre atkareigā veidā i izgluobe mitohondreju morfologeju, taidā veidā nūvieršūt neiromutacejis Mfn2KO i B attāls S7). Piec tam mes veicem in vivo eksperimentus, kab stereotaktiski nūdūtu 8 nedelis vacu Mfn2-AAV Mfn2cKO i kontrolis peļu smedziņu gorūzai, i analizējom 12 nedeļu vacys pelis (4. att. A). Apstruoduotuos Mfn2cKO pelis nūmyra (1. att., A i B) (16). Virusu puornesšona in vivo radeja selektivu PN ekspreseju dažūs mozūs smedziņu apļūs (S7, G i H attāls). Kontrolis AAV injekcejai, kas ekspresej tikai mCherry (Ctrl-AAV), nabeja nūzeimeigys ītekmis iz neirodegeneracejis pakuopi Mfn2cKO dzeivinīkim. Sovukuort ar Mfn2-AAV transducātūs Mfn2cKO analize paruodeja nūzeimeigu PN šyunu sluoņa aizsardzeibys īdarbeibu (4. att., B i C). Konkreti, ruodīs, ka neironu bleivums ir gondreiž naatškireigs nu kontrolis dzeivinīku (4. att., B i C, i S7. att., H i I). MFN1, bet na MFN2 ekspresija ir tikpat efektiva neironu nuovis gluobšonā (4. att. C i S7. att., C i F), kas nūruoda, ka ektopiskuo MFN1 ekspresija var efektivi papyldynuot MFN2 tryukumu. Tuoluokuo analize vīnā PN leiminī paruodeja, ka Mfn2-AAV lelā mārā izgluobe mitohondreju ultrastrukturu, normalizēja mtDNS leimini i apgrīze antiangiogenezis markera PCx augstū ekspresiju (4. att., C leidz E ). Izgluobtūs Mfn2cKO peļu vizualuo puorbaude atpyutys stuovūklī paruodeja, ka jūs stuovūklis i motoriskī simptomi (kusteiba S1 leidz S3) ir uzlobuoti. Nūslāgumā itī eksperimenti paruoda, ka aizkavāta MFN2 atkuortuota īvīsšona PN, kam ir stypri OXPHOS tryukums, ir pīteikama, kab maineitu mtDNS patiereņu i izraiseitu aterosklerozi, taidā veidā nūvieršūt aksonu degeneraceju i neironu nuovi in ​​vivo.
(A) Shema, kas paruoda eksperimentalū grafiku AAV injekcejai, kas kodej MFN2, kod ir aktivizāts nūruodeitais vīlmainis ceļš. (B) Reprezentativys konfokaluos fotografejis nu 12 nedeļu vacu smedziņu sekceju, kas transduceitys ar Mfn2cKO pelem 8 nedeļu laikā i markietys ar anti-Calbindin antivīlu. Pa labi: Aksonu škīdru mārūguošona. Aksonu tāluojuma mārūgs ir 450 i 75 μm. (C) Pa kreisi: Purkinjis šyunu bleivuma kvantitativa nūsaceišona AAV transdukcejis cylpā (AAV+) (vīnvierzīņa dispersejis analize; n = 3 pelis). Pa labi: mtDNS fokusa analize transducātajā PN 12. nedeļā (napuoreits t-tests; n = 6 šyunys nu treju peļu). * P <0, 05; ** P <0, 01. (D) Reprezentativys puorraidis elektronu mikrografejis Mfn2cKO smedziņu sekceju PN, kas transducātys ar nūruodeitajim virusu vektorim. Ružovuo maska ​​ilustrej dendritu aizjimtū plateibu, bet dzaltonais punktuotais laukums ilustrej pa labi nūdrūšynuotū tāluojumu; n apzeimoj kūdulu. Mārūga josla, 1μm. (E) paruoda PCx kruosuošonys pīmāru PN, kas transduceits 12 nedeļuos. Mārūga josla, 20μm. OE, puormāruota izteiksme; FC, lūcejumu maiņa.
Gols golā mes pietejom peroksidazis izraiseituos šyunu izdzeivuošonys nūzeimi PN, kas ir pīdzeivuojuši OXPHOS disfunkceju. Mes izveiduojom mCherry, kas kodej AAV-shRNS (īsuos matu sprādzis RNS), kas eipaši mierķtieceigi vierzeita iz peļu PCx mRNS (AAV-shPCx), i injicējom virusu voi tuo sakuortuotū kontroli (AAV-scr) Mfn2cKO peļu mozūs smedziņūs. Injekceja tyka veikta catūrtajā vacuma nedeļā (5. att. A), lai sasnāgtu efektivu PCx nokautu periodā, kod PCx ekspresija pīauga (3. att. C) i PN šyunu sluoņs vēļ beja naskorts (1. att. A). Ir vārts pīzeimēt, ka PCx nūgrymšona (S8A att.) nūvad pi īvārojama PN nuovis paātrynuojuma, kas ir vīneigais īrūbežuotais infekcejis gradzyns (5. att., B i C). 100 doc#1281 Lai saprostu PCx augšupejūšuos reguliešonys izraiseituos vīlmainis ītekmis mehanismu, mes pietejom PN redoks statusu piec PCx nokauda i AAV mediātais optiskais biosensors Grx1-roGFP2 tyka vīnlaiceigi izsaceits (S8 attāls, B leidz D), lai nūvārtātu glutationio peptidu). Piec tam mes veicem div fotonu fluoresciešonys myuža attāluošonys mikroskopeju (FLIM) 7 nedeļu vacu Mfn2cKO voi kontrolis metīņa bīdru akutuos smedziņu škēlēs, kab nūsaceitu īspiejamuos izmainis citoplazmys redoks statusā piec FLIM apstuokļu puorbaudis (S8 attāls, E leidz G). Analize paruodeja īvārojamu vīna Mfn2cKO PN, kam tryukst PCx ekspresejis, oksidacejis stuovūkļa pīaugumu, kas atsaškir nu kontrolis neironu voi Mfn2cKO PN, kas ekspresej tikai saškeļtu shRNS (5. att., D i E). Kod PCx ekspresija tyka regulāta iz leju, Mfn2cKO PN procents, kas paruodeja cīši oksidātu stuovūkli, pīauga par vaira nakai treis reizem (5. att. E), kas nūruoda, ka PCx augšupejūšuo reguliešona saglobuoja degenerātūs neironu redoksspieju.
(A) Shema, kas paruoda eksperimentalū grafiku AAV injekcejai, kas kodej shPCx, kod ir aktivizāts nūruodeitais vīlmainis ceļš. (B) Reprezentativys konfokaluos fotografejis nu 8 nedeļu vacu smedziņu sekceju Mfn2cKO pelei, kas transduceitys i markietys ar antikalcineurina antivīlu 4 nedeļu laikā. Mārūga josla, 450μm. (C) Purkinjis šyunu bleivuma kvantitativa nūsaceišona AAV transducātuos cylpuos (vīnvierzīņa dispersejis analize; n = 3 leidz 4 pelis). Dati izsaceiti kai videjais±SEM; ***P <0, 001. (D) Reprezentativais FLIM attāls paruoda 7 nedeļu vacu PN, kas ekspresej glutationa redoks sensoru Grx1-roGFP2, videjū myuža ilgumu nūteiktajūs eksperimentalajūs apstuokļūs. LUT (apsavieršonys tabula) attīceiba: izdzeivuošonys laika intervals (pikosekundēs). Mārūga josla, 25μm. (E) Histogramā paruodeits Grx1-roGFP2 dzeivis laika vierteibu sadalejums nu (D) (n = 158 leidz 368 šyunom divejuos pelēs kotrā apstuokļūs). Pīru diagrama viers kotrys histogramys: paruoda šyunu skaitu ar īvārojami garuokom (sorkonom, oksidātom) voi eisuokom (zylom, samazynuotom) dzeivis ilguma vierteibom, kas puorsnādz 1 SD nu videjuos dzeivis ilguma vierteibys CTRL-AAV-scr. (F) Īrūsynuotais modeļs paruoda neironu PCx augšupejūšuos reguliešonys aizsorgojūšū efektu.
Kūpumā mes ite snāgtī dati paruoda, ka MFN2 atkuortuota ekspresija var piļneibā izgluobt progresejūšu PN ar smogu OXPHOS tryukumu, smogu mtDNS nūplyusšonu i cīši naparostu ista leidzeigu morfologeju, taidā veidā nūdrūsynojūt napuortrauktu progresu pat progresejūšuos slimeibuos. Neirodegeneraceja snādz atgrīzeniskus pīruodejumus par pūsmu pyrma šyunu nuovis. Itū vīlmainis elasteibu vēļ vaira pastreipoj neironu spieja izraiseit aterosklerozi (TCA cykla puorvaduošonu), kas inhibej PCx ekspreseju PN, kam tryukst OXPHOS, i uzloboj šyunu nuovi, taidā veidā spēlejūt aizsorgojūšu lūmu (5. att. F).
Itymā pietejumā mes snēdzem pīruodejumus, ka PN atbiļde iz OXPHOS disfunkceju ir pakuopeniski konvergēt iz TCA cykla aterosklerozi caur diferencialū aktivacejis ceļu, kū aktivizej vīlmainis programys. Mes apstyprynuojom proteomiskū analizi ar daudzom papyldynojūšom metodem i atkluojom, ka, kod tūs izaicynoj smoga mitohondreju disfunkceja, neironi ir īprīkš nazynoma vīlmainis elasteibys forma. Par myusu puorsteigumim vyss puorvaduošonys process na vysod īzeimej terminalū vīlmainis stuovūkli, kas pavoda neirodegeneraceju pakuopeniski i naatgrīzeniski, tok myusu dati līcynoj, ka tys var veiduot uzturiešonys neirons pat pūsmā pyrma šyunu nuovis Funkcionalais kompensacejis mehanisms. Itys atkluojums nūruoda, ka neironim ir īvārojama vīlmainis plastiskuma pakuope organismā. Itys fakts pīruoda, ka vāluoka MFN2 atkuortuota īvīsšona var maineit golvonūs vīlmainis markeru ekspreseju i nūvērst PN degeneraceju. Taišni ūtraiži, tys nūmīrynoj aterosklerozi i paātrynoj nervus. transseksualī.
Vīns nu aizraujūšuokajim atkluojumim myusu pietejumā ir tys, ka PN, kam tryukst OXPHOS, var maineit TCA cykla metabolismu, regulejūt enzimus, kas eipaši stimulej arteriosklerozi. Metaboliskuo puorkuortuošona ir vieža šyunu izplateita īzeime, nu kurom dažys pasaļaun iz glutaminu, kab papyldynuotu TCA cykla starpproduktus, kab radeitu reducejūšūs ekvivalentus, kas vierzej elpuošonys kēdi i uztur lipidu i nukleotidu biosintezis prekursoru ražuošonu (39 , 40). Jauns pietejums paruodeja, ka periferajūs audūs, kas pīdzeivoj OXPHOS disfunkceju, radzama īzeime ir ari glutamina/glutamata metabolisma atkuortuota savīnuošona (5, 41), kur glutamina īīšonys vierzīņs TCA cyklā ir atkareigs nu OXPHOS traumu smoguma deļ (41). ). Tok tryukst skaidru pīruodejumu par neironu vīlmainis plastiskuma leidzeibu organismā i tuos īspiejamū nūzeimi slimeibu kontekstā. Naseņ veiktajā in vitro pietejumā tyka pīruodeits, ka primarī kortikalī neironi mobilizej glutamata baseinus neirotransmisejai, taidā veidā veicynojūt oksidativū metabolismu i aterosklerozi vīlmainis stresa apstuokļūs (42). Ir vārts pīzeimēt, ka TCA cykla enzima sukcinata dehidrogenazis farmakologiskajā inhibicejā teik skaiteits, ka piruvata karboksiliešona uztur oksaloacetata sintezi kulturātajūs smedziņu granulu neirōnūs (34). Tok itūs mehanismu fiziologiskajai nūzeimei smedziņu audim (kur teik skaiteits, ka ateroskleroze golvonūkuort ir īrūbežuota ar astrocitim) vys vēļ ir svareiga fiziologiska nūzeime (43). Itymā gadīnī myusu dati ruoda, ka OXPHOS bojātūs PN organismā var puorvītuot iz BCAA nūsaškeļšonu i piruvata karboksiliešonu, kas ir diveji golvonī TCA baseina starpproduktu papyldynuošonys olūti. Koč i ir īrūsynuots īspiejamais BCAA katabolisma īguļdejums neironu energejis metabolismā, papyldu glutamata i GABA lūmai neirotransmisejā (44), vys vēļ nav pīruodejumu par itim mehanismim in vivo. Deļtuo ir vīgli spekulēt, ka disfunkcionali PN var automatiski kompensēt TCA starpproduktu patiereņu, kū veicynoj asimilacejis process, palelynojūt aterosklerozi. Eipaši PCx reguliešona var byut vajadzeiga, kab uzturātu palelynuotu pīprasejumu piec asparta skuobis, kas ir pīruodeits proliferejūšajuos šyunuos ar mitohondreju disfunkceju (45). Tok myusu metabolomikys analize naatkluoja byutiskys izmainis aspartskuobis leidzsvora stuovūkļa leiminī Mfn2cKO PN (S6A attāls), kas, īspiejams, atspīgeļoj aspartskuobis atškireigū vīlmainis izmontuošonu storp proliferejūšom šyunom i postmitotiskajim neironim. Koč i precizs PCx augšupejūšuos reguliešonys mehanisms disfunkcionalajūs neirōnūs in vivo vys vēļ ir juoraksturoj, mes pīruodejom, ka itai prīkšlaiceigai atbiļdei ir svareiga lūma neironu redoksstuovūkļa uzturiešonā, kas tyka pīruodeits FLIM eksperimentūs iz smedziņu škēlem. Eipaši, nūvieršūt PN regulēt PCx, var izraiseit oksidātuoku stuovūkli i pauotrynuot šyunu nuovi. BCAA nūsaškeļšonys aktivaceja i piruvata karboksiliešona nav veidi, kai raksturuot mitohondreju disfunkcejis periferūs audus (7). Deļtam ruodīs, ka tī ir OXPHOS tryukuma neironu prioritara īzeime, pat ka na vīneiguo īzeime, kas ir svareiga neirodegeneracejai. .
Smedziņu slimeiba ir navīndabeigs neirodegenerativūs slimeibu veids, kas parosti izapauž kai atakseja i bīži viņ bojā PN (46). Itei neironu populaceja ir eipaši juoveic pret mitohondreju disfunkcejom, partū ka tūs selektivuo degeneraceja pelei ir pīteikama, kab atveiduotu daudzus motoriskūs simptomus, kas raksturoj cylvāka mugorys smedziņu atakseju (16, 47, 48). Saskaņā ar ziņuojumim, transgens peļu modeļs ar mutantu genu ir saisteits ar cylvāka spinocerebelaru atakseju i tam ir mitohondreju disfunkceja (49, 50), pastreipojūt tū, cik svareigi ir pieteit OXPHOS tryukuma sakys PNPH. Deļtam ir eipaši pīmāruots efektivi izolēt i pieteit itū unikalū neironu populaceju. Tok, jamūt vārā, ka PN ir cīši jiuteigi pret spīdīni i veidoj mozu daļu nu vysys smedziņu šyunu populacejis, daudzim iz omiku baļsteitim pietejumim tūs kai vasalu šyunu selektivuo atdaleišona vys vēļ ir izaicynuojums. Koč i ir gondreiž naīspiejami sasnēgt absolutu cytu šyunu veidu (eipaši pīaugušūs audu) pīsuorņuojuma tryukumu, mes apvīnuojom efektivu disociacejis sūli ar FACS, kab dabuotu pīteikamu skaitu dzeivuotspiejeigu neironu lejupstreipis proteomikys analizei, i ir dīzgon augsts proteinu puorkluojums (apmāram 3000 data). (51). Saglobojūt vasalu šyunu dzeivuotspieju, mes ite pīduovuotuo metode ļaun na viņ puorbaudeit izmainis vīlmainis ceļūs mitohondrejūs, bet ari puorbaudeit izmainis tuo citoplazmys leidzinīkuos, kas papyldynoj mitohondreju membranys markiejuma boguotynuošonys izmontuošonu, kas rakstureiga mitohondreju šyunu skaitam. (52., 53.). Mes apraksteituo metode ir saisteita na tik ar Purkinjis šyunu izpieti, bet tū var vīglai pīlītuot sevkura veida šyunom, kab rysynuotu vīlmainis izmainis slimeigūs smedziņūs, tymā skaitā ari cytus mitohondreju disfunkcejis modeļus.
Vysbeidzūt, mes asam identificiejuši terapeitisku lūgu itymā vīlmainis puorkuortuošonys procesā, kas var piļneibā maineit golvonuos šyunu stresa pazeimis i nūvērst neironu degeneraceju. Deļtam ite apraksteituos puorvaduošonys funkcionaluos sekys izpratne var snēgt fundamentalu īskotu par īspiejamom uorstiešonom neironu dzeivuotspiejis uzturiešonai mitohondreju disfunkcejis laikā. Vajadzeigi turpmuokī pietejumi, kuru mierkis ir izškiert izmainis energejis metabolismā cytūs smedziņu šyunu veidūs, kab piļneibā atkluotu ituo pryncypa pīmāruojameibu cytom neirologiskajom slimeibom.
MitoPark pelis ir apraksteitys jau īprīkš (31). C57BL / 6N pelis ar loxP apleik Mfn2 genim ir apraksteitys īprīkš (18) i krystuotys ar L7-Cre pelem (23). Piec tuo īgiutī dubultī heterozigoti piecguojieji tyka krustuoti ar homozigotom Mfn2loxP/Mfn2loxP pelem, kab izveiduotu Purkinja specifiskūs genu nokautus Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). Puoruošonuos apakškūpā Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP alele (apturēt-mtYFP) tyka īvīsta ar papyldu krystuošonu (20). Vysys dzeivinīku procedurys tyka veiktys saskaņā ar Eiropys, vaļstu i institucionalom nūsacejumim i apstyprynuotys LandesamtfürNatur nu Umveltys i Verbraucherschutz, Zīmeļreinys-Vestfalejis, Vuocejis. Dzeivinīku dorbs sekoj ari Eiropys Laboratorejis dzeivinīku zynuotņu asociaceju federacejis nūruodem.
Piec gryutnīceibys dzemdis kakla izvītuošonys anestejis pelis embrijs teik izolāts (E13). Gorūza tyka izdaleita Henksa leidzsvoruotajā suoļa šķīdumā (HBSS), kas papyldynuots ar 10 mM Hepes, i nūdūta Dulbecco modificātajā iergļa bareibā, kas satur papainu (20 V/ml) ​​i cisteinu (1μg/ml). Inkubej audus DMEM) i disociej tū ar enzimatiskū gramuošonu. Ml) 37°C 20 minūtis, i piec tam mehaniski slīc DMEM, kas papyldynuots ar 10% augļa gūvs serumu. Šyunys īsāja iz stykla puorkluojuma, kas puorkluotys ar polilizinu ar bleivumu 2×106 iz 6 cm kulturys trauka voi ar bleivumu 0,5×105 šyunu/cm2 attāluošonys analizei. Piec 4 stuņžu bareiba tyka aizstuota ar bareibu bez Neurobasal seruma, kas satur 1% B27 papyldynuojumu i 0,5 mM GlutaMax. Piec tuo neironus uzturēja 37°C i 5% CO2 vysa eksperimenta laikā i baroj reizi nedeļā. Kab izraiseitu rekombinaceju in vitro, ūtrā dīnā in vitro neironu uorstiešonai izmontuoja 3 μl (24 bedreišu kulturys trauks) voi 0,5 μl (24 bedreišu plāksne) nu itaida AAV9 virusa vektora: AAV9.CMV.PI.eGFP. 100 doc#1281 WPRE.bGH (papyldynuojums, kataloga numurs 105530-AAV9) un AAV9.
Peļu Mfn1 i Mfn2 papyldynojūšuo DNS (īgiuta attīceigi nu Addgene plazmidys #23212 i #23213) ir apzeimuota ar V5 sekveņci (GKPIPNPLLGLDST) C-golā i teik sapludynuota ar mCherry kadrā caur T2A sekveņci. Grx1-roGFP2 ir Heidelbergys TP Dika DFKZ (Vuocejis pietnīceibys centrs) duovona. Aizstuojūt tdTomato kaseti, izmontojūt parostuos kloniešonys metodis, kasete tyka subklonāta pAAV-CAG-FLEX-tdTomato mugorā (Addgene atsaucis numurs 28306), kab izveiduotu pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFGAV-V5, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFGAV-V5, 100 doc#1281 FLEX-mČerijs-T2A-MFN1-V5 un pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 vektori. Leidzeiga strategeja tyka izmontuota, kab izveiduotu kontrolis vektoru pAAV-CAG-FLEX-mCherry. 100 doc#1281 Lai izveiduotu AAV-shPCx konstrukceju, ir vajadzeigs plazmidys AAV vektors (VectorBuilder, pAAV [shRNS] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNS#1]), kas satur DNS sekveņci, kas kodej shRNS mierķtieceigū peļu PCx (5′ 3′) U6 promotora kontrolē mCherry lītoj CMV promotora kontrolē. PaleigAAV vektoru ražuošona tyka veikta piec ražuotuoja nūruodejumim (Cell Biolabs). Īsuokumā izmontoj puornesšonys plazmidu, kas nas mČeri-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mČeri-T2A-MFN2-V5), mČeri-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mČeri) puorīmūši 2012. g. (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) voi Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) kodejūšū genu, kai ari kodejūšū AAV1 kapsida proteinu i pīdaru proteinu Īpakuojuma plazmidys plazmidu, izmontojūt kalceja fosfata metodi. Naapstruoduotū virusa supernatantu īgiva ar sasaļšonys-atkauseišonys ciklim sausajā lada/etanola vannā i lizejūt šyunys fosfatu buferātajā suoļa šķīdumā (PBS). AAV vektoru atteireja ar puortrauktu jodiksanola gradienta ultracentrifugaceju (24 stuņdis 32 000 apgr./min. i 4°C) i koncentrēja, izmontojūt Amicon ultra-15 centrbēdzes filtru. AAV1-CAG-FLEX-mČeri-T2A-MFN2-V5 [2,9 × 1013 genoma kopeja (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mČeri (6,1 × 1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX-mČeri (6,1 × 1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX kvantitativais apraksteits ar laiku, tyka izmiereits kai īprīkš (PCR). (qPCR) -MFN1-V5 (1,9 × 1013 GK/ml) un AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8,9 × 1012 GK/ml).
Primarī neironi tyka nūkosuoti ladaini soltā 1x PBS, granulāti i piec tam homogenizāti 0,5% Triton X-100 / 0,5% nātrejis dezoksiholatā/PBS lizis buferā, kas satur fosfatazi i proteazis inhibitoru (Roche). Ūlboltumvīlu kvantitativu nūsaceišonu veice, izmontojūt bicinhoninskuobis testu (Thermo Fisher Scientific). Piec tuo proteinus atdaleja ar SDS-poliakrilamida gela elektroforezi i piec tuo izsvīde iz polivinilidena fluorida membranys (GE Healthcare). Blokej naspecifiskys vītys i inkubej ar primarū antivīlu (detalizātuok vērtīs S1 tabulā) 5% pīnā TBST (Tris buferāts suoļa šķīdums ar Tween), mozguošonys sūļūs i sekundarū antivīlu TBST inkubacejā. Inkubej ar primarū antivīlu nakti +4°C. Piec mozguošonys sekundarū antivīlu uzlīk 2 stuņdis ustobys temperaturā. Piec tuo, inkubejūt tū pošu blotu ar anti-β-aktina antivīlu, tyka apstyprynuota tei poša slodze. Atkluošona, puorvieršūt kimiluminiscenci i uzlobojūt kimiluminiscenci (GE Healthcare).
Neironi, kas īprīšk īsāti iz stykla puorkluojumu, tyka fiksāti ar 4% paraformaldehidu (PFA)/PBS nūteiktā laika punktā ustobys temperaturā 10 minotys. Pārkluojumi vysupyrma 5 minotys ustobys temperaturā caurlaiž ar 0,1% Triton X-100/PBS, piec tam blokejūšajā buferā [3% gūvu seruma albumins (BSA)/PBS]. Ūtrajā dīnā puorkluojumus izmozguoja ar blokejūšū buferu i inkubēja ar atbylstūšu fluoroforu konjugātū sekundarū antivīlu 2 stuņdis ustobys temperaturā; beidzūt paraugus ryupeigi izmozguoja PBS ar 4′,6-diamidino-2 -Fenilindolu (DAPI) ir pretkruosuots i piec tam fiksāts iz mikroskopa slīdis ar Aqua-Poly/Mount.
Pelis (tieveņi i sīvītis) anestezēja ar ketamina (130 mg/kg) i ksilazina (10 mg/kg) injekceju vādarā i īlyka zemuodā ar karprofena pretsāpju leidzekli (5 mg/kg) , I īlyka stereotaktiskajā instrumentā (Kopd a war pamf) īkuortā. Atkluot golvyskausu i ar zūbu urbi atplāst mozūs smedziņu gorys daļu, kas atbylst mis kaulam (nu lambdys: aste 1,8, suonu 1, atbylstūši IV i V lūceitovom). Izmontojūt izlīktu špricis adatu, ryupeigi izveiduotu nalelu caurumu golvyskausā, kab naizjauktu zamuok asūšū vaskulaturu. Tod pluonū izvylktū stykla kapilaru lānai īlīk mikrocaurumā (nu -1,3 leidz -1 cītuos vīlys ventralajā pusē), i mikroinžektorā (Narishige) ar manualom špricem (Narishige) īlīk 200 leidz 300 nl AAV ar manualom špricem (Narishige) spīdīņa periodā nu sever1. minotu lūgs. Piec infuzejis kapilaru līk vēļ 10 minotys, kab viruss varātu piļneibā izaplateit. Piec kapilaru izjimšonys uodu ryupeigi šyuj, kab samazynuotu bryuču īkaisumu i ļautu dzeivinīkam atsaveseļuot. Dzeivinīkus vairuokys dīnys piec operacejis uorstēja ar analgetikim (kaspofenu), tymā laikā tyka ryupeigi uzraudzeits jūs fiziskais stuovūklis i piec tam nūruodeitajā laika punktā tyka eitanizēti. Vysys procedurys tyka veiktys saskaņā ar Eiropys, vaļsts i institucionalajom nūsacejumim i tyka apstyprynuotys LandesamtfürNatur nu Umveltys i Verbraucherschutz, Zīmeļreinys-Vestfalejis, Vuocejis.
Dzeivinīkus anestezēja ar ketaminu (100 mg/kg) i ksilazinu (10 mg/kg), sirdi pyrma perfuzēja ar 0,1 M PBS, piec tam ar 4% PFA PBS. Audi tyka atdaleiti i fiksāti 4% PFA/PBS nakti 4°C. Vibrejūšs nazis (Leica Microsystems GmbH, Vīne, Austreja) tyka izmontuots, kab sagataveitu sagitaluos sekcejis (50 μm bīzi) nu fiksātūs smedziņu PBS. Ka nav nūruodeits cytaiži, breivi plūstūšūs sekceju kruosuošona tyka veikta, kai apraksteits īprīkš (13), ustobys temperaturā i maisūt. Īsuokumā pyrma tuo īgiutuos škēlis 15 minotys ustobys temperaturā caurlaideja ar 0,5% Triton X-100/PBS; dažim epitopim (Pcx i Shmt2), tris-EDTA buferā 80°C (PH 9) škēlis sakarsej 25 minotys, navys ituo sūļa. Piec tuo sekcejis inkubēja ar primarū antivīlu (vērtīs S1 tabulu) blokejūšajā buferī (3% BSA/PBS) 4°C nakti, maisūt. Ūtrā dīnā sekcejis izmozguoja ar blokejūšū buferu i inkubēja ar atbylstūšu fluoroforu konjugātu sekundarū antivīlu 2 stuņdis ustobys temperaturā; beidzūt sekcejis tyka ryupeigi izmozguotys PBS, pretkruosuotys ar DAPI, piec tam fiksātys ar AquaPolymount Iz mikroskopa slīdis.
Parauga attāluošonai tyka izmontuots lazera skeniešonys konfokalais mikroskops (TCS SP8-X voi TCS digitaluo gaismys lopa, Leica Microsystems), kas aprīkots ar boltuos gaismys lazeru i 405 diožu ultravioletū lazeru. Satraucūt fluoroforu i apkūpojūt signalu ar hibridū detektoru (HyDs), LAS-X programaturu izmontuoja, kab apkūpuotu sakrautus attālus, kas atbylst Nikvista paraugu jimšonai seceigā režimā: nakvantitativim panelim tī ir cīši dinamiski signali (par pīmāru, somatiskajuos šyunuos i dendritūs) dect UFPY mt SpylgtsR režims). Kab samazynuotu fonu, teik izmontuots 0,3 leidz 6 ns vārti.
Sakuortuotu šyunu attāluošona realajā laikā. Piec sakuortuošonys Neurobasal-A bareibā, kas satur 1% B27 papyldynuojumu i 0,5 mM GlutaMax, šyunys izreiz īsāja iz poli-l-lizina puorkluotom stykla slīdem (μ-Slide8 Nu, Tīpat, kataloga numurs 80826) , I tod tū turēja a°C un 326. apsameteit. Attāluošona realajā laikā tyka veikta iz Leica SP8 lazera skeniešonys konfokaluo mikroskopa, kas aprīkots ar boltu lazeru, HyD, 63×[1,4 skaitliskuos atvāruma (NA)] eļlis objektiva objektivu i apkuris pūsmu.
Peli dreiži anestezēja ar ūglekļa dioksidu i nūcierst golvu, smedzini dreiži izjēme nu golvyskausa, i sagrīze 200μm bīzā (13C markiešonys eksperimentam) voi 275μm bīzā (divejim fotonu eksperimentim) sagitalajā sekcejā, kas pīpiļdeita ar itaidim creceam materialim The VHr50). Scientific, Valdorfa, Vuoceja) ir pīpiļdeits ar itaidom vīlom: 125 mM ladaini solts, ar ūglekļa pīsuotynuots (95% O2 i 5% CO2) moz Ca2 + muoksleigais smedziņu škidrums (ACHCSF) NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM Natrejis m2, 1,25 mM nātrejis m2. glikoze, 0,5 mM CaCl2 un 3,5 mM MgCl2 (osmotiskais spīdīņs nu 310 leidz 330 mmol). Īgiutuos smedziņu škēlis puornas iz pyrminkubacejis kameru, kas satur augstuoku Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM nātrejis fosfata bufers, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glikoze, 100 mM Ca2l). MgCl2) Videjais) pH 7,4 un 310 līdz 320 mmol).
Attāluošonys procesa laikā škēlis tyka puorvītuotys iz specialu attāluošonys telpu, eksperimentu veice napuortrauktā ACSF perfuzejā konstantā temperaturā nu 32° leidz 33°C. Šķēļu attāluošonai izmontuoja daudzfotonu lazera skeniešonys mikroskopu (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems), kas aprīkots ar Leica 25x objektivu (NA 0,95, iudiņs), Ti: Safira lazeru (Hameleona redze II, Koherents). FLIM modulis (PikoHarp300, PikoKvants).
Grx1-roGFP2 FLIM. Izmainis PN citoplazmys redoks stuovūklī miereja ar div fotonu FLIM sagitaluos smedziņu škēlēs, kur Grx1-roGFP2 biosensors mierķtieceigi vierzeja iz PN. PN sluonī īgivis lauks teik izvālāts apmāram 50 leidz 80 μm zam škēlis viersmys, kab nūdrūsynuotu, ka ir dzeivuotspiejeigs PN (tys ir, krellis strukturys tryukums voi neironu morfologiskuos izmainis gar dendritim) i dubultais pozitivais seGFP2 sensors i AAVx ncex ikodejūšais shRNA mVīšņa). Apkūpuot vīnys kaudzis attālus ar 2x digitalū tāluojumu [īrūsynuošonys viļņa garums: 890 nm; 512 nm 512 pikseli]. Atkluošona: īkšejais HyD, fluoresceina izotiocianata (FITC) filtra grupa] i attālu videjais 2 leidz 3 minotu laikā teik izmontuots, kab nūdrūsynuotu, ka teik savuokti pīteikūši daudz fotonu (kūpā 1000 fotonu) līknis pīlītuošonai. Grx1-roGFP2 zondis jiuteiba i FLIM apstuokļu puorbaude tyka veikta, uzraudzūt roGFP2 dzeivis ilguma vierteibu, pīvīnojūt eksogenū 10 mM H2O2 perfuzejai ACSF (lai palelynuotu oksidaceju, kuo rezultatā palelynuotu degreetizolu of2). samazynuošona, kuo rezultatā sasamazynoj dzeivis ilgums) (S8 att., D leidz G). Izmontojūt FLIMfit 5.1.1 programmatūru, lai analizātu īgiutūs rezultatus, pīlāgoj vysa attāla vīnu eksponencialū sabrukšonys līkni izmiereitajam IRF (instrumenta atbiļdis funkceja), i χ2 ir apmāram 1. Lai apriekinuotu vīna PN dzeivis laiku, maska ​​beja manuāli draw a nervu . izmontoj kvantitativai nūsaceišonai.
Mitohondreju potenciala analize. Piec akutuos sekcejis inkubiešonys ar 100 nM TMRM, kas taišni pīvīnuots perfuzātajam ACSF 30 minotys, PN mitohondreju potencialuos izmainis miereja ar divfotonu mikroskopu. TMRM attāluošona tyka veikta, uztraucūt zondi 920 nm i izmontojūt īkšejū HyD (tetrametilrodamina izotiocianats: 585/40 nm), kab apkūpuotu signalus; izmontojūt tū pošu īrūsynuošonys viļņa garumu, bet izmontojūt cytu īkšejū HyD (FITC :525/50), lai attāluotu mtYFP. Izmontojit ImageJ attālu kalkulatora spraudni, kab nūviertētu mitohondreju potencialu vīnys šyunys leiminī. Īsuokumā spraudņa vīnaiduojumu: signals = min (mtYFP, TMRM) izmontoj, kab identificātu mitohondreju regionu, kas paruoda TMRM signalu Purkinjis somali volūdā attīceiguo kanala vīnys kaudzis konfokalajā attālā. Piec tuo īgiutajā maskā teik nūsaceits pikseļu laukums i piec tam normalizāts iz attīceiguo mtYFP kanala slīkšņa vīnys kaudzis attāla, kab dabuotu mitohondreju frakceju, kas paruoda mitohondreju potencialu.
Attāls tyka atdaleits ar Huygens Pro (Zynuotniskuo apjūma attāluošonys) programaturu. Skenātajom fližu biļdem vīnys flizis montaža teik veikta, izmontojūt LAS-X programys nūdrūsynuotū automatiskū šyušonys algoritmu. Piec attāla kalibracejis izmontoj ImageJ i Adobe Photoshop, kab tuoļuok apstruoduotu attālu i vīnmiereigi pīlāguotu spylgtumu i kontrastu. Grafiskai sagataveišonai izmontoj Adobe Illustrator.
mtDNS fokusa analize. mtDNS bojājumu skaits tyka nūsaceits iz smedziņu sekcejom, kas markietys ar antivīlom pret DNS, izmontojūt konfokalū mikroskopu. Kotrys mierķa laukums tyka izveiduots šyunu kermeņam i kotra šyunys kūdulam, i attīceigais laukums tyka apriekinuots, izmontojūt Multi Measure spraudni (ImageJ programatura). Atjam kūdula laukumu nu šyunu kermeņa laukuma, kab dabuotu citoplazmys laukumu. Gols golā tyka izmontuots spraudnis Analyze Particles (ImageJ programatura), kab automatiski nūsaceitu citoplazmys DNS punktus, kas nūruoda iz mtDNS iz slīkšņa attāla, i īgiutī rezultati tyka normalizāti leidz CTRL peļu PN videjam. Rezultati teik izsaceiti kai videjais nukleozidu skaits iz vīnu šyunu.
Ūlboltumvīlu izteiksmis analize. Izmontojit ImageJ attālu kalkulatora spraudni, kab nūviertētu proteina ekspreseju PN vīnys šyunys leiminī. Īsuokumā attīceiguo kanala vīnsluoņa konfokalajā attālā, izmontojūt vīnaiduojumu: signals = min (mtYFP, antivīla), teik identificāts mitohondreju regions, kas paruoda imunoreaktivitati pret nūteiktu antivīlu Purkina. Piec tuo īgiutajā maskā teik nūsaceits pikseļu laukums i piec tuo normalizāts iz attīceiguo mtYFP kanala slīkšņa vīnys kaudzis attāla, kab dabuotu paruodeituo proteina mitohondreju daļu.
Purkinjis šyunu bleivuma analize. ImageJ šyunu skaiteituoja spraudnis tyka izmontuots, kab nūviertētu Purkinjis bleivumu, dolūt skaiteitūs Purkinjis šyunu skaitu ar skaiteitūs šyunu aizjimtuo mozūs smedziņu gradzyna garumu.
Paraugu sagataveišona i vuokšona. Kontrolis grupys i Mfn2cKO peļu smedzini tyka fiksāti 2% PFA/2,5% glutaraldehidā 0,1 M fosfata buferī (PB), piec tam koronaluos sekcejis tyka sagataveitys, izmontojūt skrūpsteņus (Leica Mikrosysteme GmbH, Vīne, Austreja) (Bīzums μm1 leidz The60 bufers). tetraoksidu i 1,5% kāleja ferocianidu ustobys temperaturā 1 stuņdi. Sekcejis treis reizis izmozguoja ar destilātu iudini, piec tam 20 minotys īkruosuoja ar 70% etanolu, kas satur 1% uranilacetatu. Piec tuo sekcejis tyka dehidratātys klasificātajā spirtā i īlyktys Durcupan ACM (Araldita līšonys sveķi M) epoksidveida sveķūs (Elektronu mikroskopejis zynuotnis, kataloga numurs 14040) storp ar siliceju puorkluotom stykla slīdem i vysbeidzūt 60°C polimerizātys ceplī. Tyka atlaseita mozūs smedziņu gorys laukums i 50 nm ultrapluonys sekcejis tyka sagrīztys iz Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Vīne, Austreja) i izvylktys iz 2×1 mm vara spraugys režģa, kas puorkluots ar polistirola plēvi. Sekcejis tyka īkruosuotys ar 4% uranilacetata šķīdumu H2O 10 minotys, vairuokys reizis izmozguotys ar H2O, piec tam ar Reinoldsa svyna citratu H2O 10 minotys, piec tam vairuokys reizis izmozguotys ar H2O. Mikrografejis tyka uzjimtys ar puorraidis elektronu mikroskopu Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Voltema, Massačusets, ASV), izmontojūt TVIPS (Tieca video i attālu apstruodis sistema) TemCam-F416 digitalū fotoaparatu (TVIPS GmbH, Gauting, ASV). Vuocejā).
Ar AAV inficātom pelem smedzini tyka atdaleiti i sagrīzti 1 mm bīzā sagitalajā sekcejā, mozūs smedziņus puorbaudeja, izmontojūt fluoresciešonys mikroskopu, kab identificātu ar AAV inficātū gradzynu (tys ir, mCherry ekspresejūšū). Izmontoj tikai eksperimentus, kurūs AAV injekcejis rezultatā ir cīši augsta Purkinjis šyunu sluoņa (t.i., gondreiž vysa sluoņa) transdukcejis efektivitate vysmoz divejūs smedziņu gradzynūs piec kuortys. AAV transducātuo cylpa tyka mikrodisecāta nakts postfiksacejai (4% PFA i 2,5% glutaraldehids 0,1 M kakao buferī) i tuoļuok apstruoduota. EPON īgulšonai fiksātūs audus izmozguoja ar 0,1 M nātrejis kakao buferu (Applichem), inkubēja ar 2% OsO4 (os, Zynuotnis dīnasts; Caco) 0,1 M nātrejis kakao buferā (Applichem) 4 stuņdis, piec tam izmozguoja 2 stuņdis. Atkuortuot 3 reizis ar 0,1 M kokamida buferu. Piec tuo izmontuoja augūšū etanola sereju, kab kotru etanola škeidumu inkubātu 4°C 15 minutis, kab dehidratātu audus. Audus puornese iz propilena oksidu i inkubēja nakti EPON (Sigma-Aldrich) 4°C. Īlīk audus svaigā EPON ustobys temperaturā iz 2 stuņdem, i tod īlīk 62°C iz 72 stuņdem. Izmontojūt ultramikrotomu (Leica Microsystems, UC6) i dimanta nazi (Diatome, Biel, Šveice), sagrīž 70 nm ultrapluonys sekcejis, i 15 minotys 37°C īkruosoj ar 1,5% uranilacetatu, i 4 minotys īkruosoj ar svyna citrata šķīdumu. Elektronu mikrografejis tyka uzjimtys, izmontojūt JEM-2100 Plus puorraidis elektronu mikroskopu (JEOL), kas aprīkots ar 16 bitu kameru OneView 4K (Gatan) i DigitalMicrograph programaturu (Gatan). Analizei elektronu mikrografejis tyka īgiutys ar 5000× voi 10 000× digitalū tāluojumu.
Mitohondreju morfologiskuo analize. Vysom analizem atsevišku mitohondreju konturys tyka manuali īzeimuotys digitalajūs attālūs, izmontojūt ImageJ programaturu. Teik analizāti dažaidi morfologiskī parametri. Mitohondreju bleivumu izsoka kai procentu, kas dabuots, dolūt kotra šyunys kūpejū mitohondreju laukumu ar citoplazmys laukumu (citoplazmys laukums = šyunu laukums-šyunu kūdula laukums) × 100. Mitohondreju opolumu apriekinoj ar formulu [4π∙2(laukums)]./perimetrs. Mitohondreju ista morfologeja tyka analizāta i sadaleita divejuos kategorejuos („cauruļveida” i „putekļu”) piec tūs golvonūs formu.
Autofagosomu/lizosomu skaita i bleivuma analize. Izmontojūt ImageJ programaturu, digitalajā attālā manuali īzeimuotu kotra autofagosomys/lizosomys konturys. Autofagosomys/lizosomys laukums teik izsaceits kai procents, kas apriekinuots, dolūt kotra šyunys kūpejū autofagosomys/lizosomys strukturys laukumu ar citoplazmys laukumu (citoplazmys laukums=šyunu laukums-kūdula laukums)×100. Autofagosomu/lizosomu bleivumu apriekinoj, dolūt kūpskaitu ar autofagosomu/lizosomu strukturu skaitu iz vīnu šyunu (citoplazmys laukuma ziņā) (citoplazmys laukums = šyunu laukums-kūdullaukums).
Markēšona akutai škārsgrīzšonai i paraugu sagataveišonai. Eksperimentim, kurim vajadzeiga glikozis markiešona, puornas akutuos smedziņu škēlis iz pyrmsinkubacejis kameru, kurā ir pīsuotynuots ūgleklis (95% O2 i 5% CO2), augsts Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM nātrejis m2O, 1,25 mM nātrejis fosfats. 25,0 mM d-glikozes, 1,0 mM CaCl 2 un 2,0 mM MgCl 2, pīlāgōti pH 7,4 un 310 leidz 320 mOsm), kurā glikoze ir 13 C 6- Glikozes aizvītōšona (Eurisotop, kataloga numurs CLM9-1). Eksperimentim, kurim vajadzeiga piruvata markiešona, akutuos smedziņu škēlis puornas iz augstuoku Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM nātrejis fosfata bufers, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM Ad.glikoze, Ca02M m1). 100 doc#1281 MgCl2, pīlāgoj pH 7,4 un 310 leidz 320 mOsm), un pīvīnoj 1 mM 1-[1-13C]piruvātu (Eurizotops, kataloga numurs CLM-1082). Sekcejis inkubej 90 minūtis 37°C. Eksperimenta beiguos sekcejis dreiži izmozguoja ar iudiņa škeidumu (pH 7,4), kas satur 75 mM amonija karbonatu, piec tam homogenizēja 40:40:20 (v:v:v) acetonitrilā (ACN): metanols: iudiņs. Piec sekceju inkubacejis iz lada 30 minotys, paraugus centrifugēja 21 000 g 10 minotys 4°C, skaidrū supernatantu žāluoja SpeedVac koncentratorā. Dabuotuos žāluotuos metabolita granulys uzglobuoja -80°C leidz analizei.
C markietu aminoskuobu škidruos hromatografejis-masys spektrometrejis analize. Škidruos hromatografejis-masys spektrometrejis (LC-MS) analizei metabolitu granulys atkuortuoti suspendēja 75 μl LC-MS kvalitatis iudinī (Honeywell). Piec centrifugacejis 21 000 g 5 minutis 4°C 20 μl nūskaidruotuo supernatanta izmontuoja aminoskuobu plyusmys analizei, bet puorejū ekstraktu izreiz izmontuoja anjonu analizei (vērtīs zamuok). Aminoskuobu analize tyka veikta, izmontojūt īprīkš apraksteitū benzoilhlorida atvasynuošonys protokolu (55, 56). Pyrmajā sūlī 20 μl metabolita ekstraktam pīvīnuoja 10 μl 100 mM nātrejis karbonata (Sigma-Aldriha), piec tam LC pakuopis ACN pīvīnuoja 10 μl 2% benzoilhlorida (Sigma-Aldriha). Paraugu eisu laiku vierpuļuoja i piec tam centrifugēja 21 000 g 5 minutis 20°C. Pīlīc nūteireitū supernatantu iz 2 ml autoparaugu flakonu ar konisku stykla īliktni (200 μl tylpums). Paraugi tyka analizāti, izmontojūt Acquity iClass cīši augstys veiktspējys LC sistemu (Waters), kas savīnuota ar Q-Exactive (QE)-HF (Ultra augsta lauka orbitrapa) augstys izškiertspiejis precizitatis masys spektrometru (Thermo Fisher Scientific). Analizei 2μl atvasynuotuo parauga īlyka 100×1,0 mm augsta stypruma siliceja T3 kolonā (Waters), kas satur 1,8μm dalenis. Plūsmys ātrums ir 100μl/min, a bufera sistema sastuov nu bufera A (10 mM amonija formiata i 0,15% mudrskuobis iudinī) i bufera B (ACN). Gradients ir taids: 0%B 0 minotuos; 0%B. 0 leidz 15% B 0 leidz 0,1 minotā; 15 leidz 17% B 0,1 leidz 0,5 minotuos; B pi 17 leidz 55% pi 0,5 leidz 14 minotom; B pi 55 leidz 70% 14 leidz 14,5 minotuos; pi 14,5 leidz 70 leidz 100% B 18 minotuos; 100% B 18 leidz 19 minotu laikā; 100 leidz 0% B 19 leidz 19,1 minotuos; 0% B 19,1 leidz 28 minotom (55, 56). QE-HF masys spektrometrs dorbojās pozitivā jonizacejis režimā ar masys diapazonu m/z (masys/luodeņa attīceiba) nu 50 leidz 750. Pīmāruotuo izškiertspieja ir 60 000, i īgiutais pīauguma kontrolis (AGC) jonu mierkis ir 3×106, i maksimalais jonu millico1. Apsiļdeitais elektrosmiļkšu jonizacejis (ESI) olūts dorbojās ar smiļkšu sprīgumu 3,5 kV, kapilaru temperaturu 250°C, apvalka gaisa plyusmu 60 AU (pošvaleigys vīneibys) i paleiggaisa plyusmu 20 AU. 250°C. S objektivs ir īstateits iz 60 AU.
13C markietu organiskūs skuobu anjonu hromatografejis-MS analize. Atlykušūs metabolitu nūgulumus (55 μl) analizēja, izmontojūt Dionex jonu hromatografejis sistemu (ICS 5000+, Termo Fišera Zynuotnis), kas savīnuota ar QE-HF masys spektrometru (Termo Fišera Zynuotnis). Īsuokumā 5μl metabolita ekstrakta īlyka Dionex IonPac AS11-HC kolonā, kas aprīkota ar HPLC (2 mm×250 mm, daleņu izmārs 4μm, Thermo Fisher Scientific) īspīžamajā dalejā cylpys režimā ar pīpiļdeišonys attīceibu 1. )on. 100 doc#1281 Aizsardzeibys kolona (2 mm x 50 mm, 4 μm, termofišera zynuotniskais). Kolonys temperatura teik uzturāta 30°C, i autoparaugu jimtuojs teik īstateits iz 6°C. Izmontojit kāleja hidroksida kasetni, kas nūdrūsynuots ar dejonizētu iudini, kab caur eluenta generatoru radeitu kāleja hidroksida gradientu. Metabolitu atdaleišona ar plyusmys ātrumu 380μl/min, pīlītojūt itaidus gradientu: 0 leidz 3 minotom, 10 mM KOH; 3 leidz 12 minotom, 10 leidz 50 mM KOH; 12 leidz 19 minotom, 50 leidz 100 mM KOH; 19 leidz 21 minotom , 100 mM KOH; 21 leidz 21,5 minotom, 100 leidz 10 mM KOH. Kolonu otkon īleidzynuoja zam 10 mM KOH 8,5 minotys.
Eluātī metaboliti teik apvīnuoti ar 150 μl/min izopropanola papyldynuojuma straumi piec kolonys i piec tam nūvierzeiti iz augstys izškiertspiejis masys spektrometru, kas dorbojās nagativā jonizacejis režimā. MS uzrauga masys diapazonu nu m/z 50 leidz 750 ar izškiertspieju 60 000. AGC ir īstateits iz 1×106, i maksimalais jonu laiks teik turāts iz 100 ms. Apsiļdeitais ESI olūts dorbuojuos ar 3,5 kV izsmidzinuošonys sprīgumu. Cyti jonu olūta īstatejumi ir taidi: kapilaru temperatura 275°C; apvalka gazis plyusma, 60 AU; paleiggazis plyusma, 20 AU 300°C, i S objektiva īstatejums iz 60 AU.
13C markietūs metabolitu datu analize. Izmontuot TraceFinder programaturu (4.2. verseja, Termo Fišera zynuotniskuo) izotopu attīceibys datu analizei. Kotrys savīnuojuma identitati puorbaudeja ar uztycamu atsaucis savīnuojumu i naatkareigi analizēja. Kab veiktu izotopu boguotynuošonys analizi, kotra 13C izotopa (Mn) ekstrahātuos jonu hromatogramys (XIC) laukums tyka izjimts nu [M + H] +, kur n ir mierķa savīnuojuma ūglekļa skaits, kū izmontoj aminoskuobu analizei voi [ MH] + izmontoj anjonu analizei. XIC masys precizitate ir mozuoka par pīcom daļom iz miļjonu, bet RT precizitate ir 0,05 minotys. Boguotynuošonys analizi veic, apriekinojūt kotra atkluotuo izotopa attīceibu pret vysu attīceiguo savīnuojuma izotopu summu. Ituos attīceibys teik dūtys kai procentualuos vierteibys kotram izotopam, i rezultati teik izsaceiti kai molaruo procentualuo boguotynuošona (MPE), kai apraksteits īprīkš (42).
Sasaldātuos neironu granulys homogenizēja ladaini soltā 80% metanolā (v/v), vierpuļuoja i inkubēja -20°C 30 minotys. Otkon vierpuļoj paraugu i 30 minūtis maisej +4°C. Paraugu centrifugēja 21 000 g 5 minutis 4°C, piec tam īgiutū supernatantu savuoce i izkaļteja, izmontojūt SpeedVac koncentratoru 25°C tuoluokai analizei. Kai apraksteits īprīkš, LC-MS analize tyka veikta iz sakuortuotūs šyunu aminoskuobu. Izmontojūt TraceFinder (4.2. verseja, Thermo Fisher Scientific), datu analize tyka veikta, izmontojūt kotra savīnuojuma monoizotopiskū masu. Metabolitu datu kvantila normalizaceja tyka veikta, izmontojūt preprocessCore programmatūrys paku (57).
Šķēļu sagatavuošona. Peli dreiži anestezēja ar ūglekļa dioksidu i nūcierst golvu, smedzini tyka dreiži izjimti nu golvyskausa, i ar ladu pīpiļdeitu vibrejūšū nazi (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Valdorfa, Vuoceja) tyka sagrīzts 300 leidz 375 μm Colgittal sa5d. CO2) Zems Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM nātrija fosfata bufers, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glikoze, 1,0 mM CaCl2 un 6,0 mM MgCl302. mOsm). Īgiutūs smedziņu škēlis puornas iz kameru, kurā ir augstuoks Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM nātrejis fosfata bufers, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glikoze, 4,0 mM M3lC5. un 310 līdz 320 mOsm). Uzglobuot škēlis 20 leidz 30 minotys, kab tuos varātu atjaunuot pyrma īroksta.
īroksts. Vysim īrokstim tyka izmontuots mikroskopa skotuvis, kas aprīkots ar fiksātu īroksta kameru i 20x iudinī īgremdiešonys objektivu (Scientifica). Īspiejamuos Purkinjis šyunys tyka nūsaceitys piec (i) kermiņa izmāra, (ii) mozūs smedziņu anatomiskuos atsarasšonys vītys i (iii) fluoresciejušuo mtYFP reportera gena ekspresejis. 100 doc#1281 Plākstera pipeti ar gola pretesteibu nu 5 leidz 11 megomim izvylk borosilikata stykla kapilars (GB150-10, 0,86 mm×1,5 mm×100 mm, Zynuotnis izstruoduojumi, Hofheims, Vuoceja) i horizontaluo pipete Instruments (P-1000), No. Vysus īrokstus veice ELC-03XS npi plāksteru spaiļu pastyprynuotuojs (npi elektronic GmbH, Tam, Vuoceja), kuru vadeja programatura Signal (6.0 verseja, Kembridžys elektroniskuo, Kembridža, Apvīnuotuo Karaliste). Eksperiments tyka īraksteits ar paraugu jimšonys uotrumu 12,5 kHz. Signals teik filtrāts ar divejim īsuos caurlaidis Besela filtrim ar rūbežfrekveņcem attīceigi 1,3 i 10 kHz. Membranys i pipetis kapacitati kompensej kompensacejis kēde, izmontojūt pastyprynuotuoju. Vysus eksperimentus veice Orca-Flash 4.0 kamerys (Hamamacu, Gerdena, Vuoceja) kontrolē, kū kontrolēja Hokawo programatura (2.8. verseja, Hamamacu, Gerdena, Vuoceja).
Rutinveida vysu šyunu konfiguriešona i analize. Izreiz pyrms īraksteišonys pipeti pīpiļdeit ar īkšejū šķīdumu, kas satur itaidys vīlys: 4,0 mM KCl, 2,0 mM NaCl, 0,2 mM EGTA, 135,0 mM kāleja glikonats, 10,0 mM Hepes, 4,0 mM Gufano.TPG5g) (Na) i 10,0 mM kreatinina fosfats tyka pīlāguots pH 7,25, i osmotiskais spīdīņs beja 290 mOsm (saharoze). Izreiz piec 0 pA spāka pīlītuošonys membranys plīsšonai tyka izmiereits atpyutys membranys potencials. Īvadis pretesteibu mierej, pīlītojūt hiperpolarizātys struovys -40, -30, -20, i -10 pA. Izmierej sprīguma reakcejis lelumu i izmontoj Oma lykumu, kab apriekinuotu īvadis pretesteibu. Spontanuo aktivitate tyka īraksteita sprīguma spailē 5 minotys, i sPSC tyka identificāts i miereits Igor Pro (verseja 32 7.01, WaveMetrics, Osvigo azars, Oregona, ASV), izmontojūt pusautomatiskū atpazeišonys skriptu. IV līkni i leidzsvora struovu mierej, saspīžūt akumulatoru dažaidūs potencialūs (suocūt nu -110 mV) i palelynojūt sprīgumu 5 mV sūļūs. AP ražuošona tyka puorbaudeita, pīlītojūt depolarizejūšū struovu. Pīspīž šyunu pi -70 mV, pīlītojūt depolarizejūšū strāvys impulsu. Kotrys īroksta bloka sūļa izmāru pīlāgoj atseviški (10 leidz 60 pA). Apriekinojit maksimalū AP frekvenci, manuali saskaitūt impulsu smailis, kas izraisa augstuokū AP frekvenci. AP slīksni analizej, izmontojūt depolarizacejis impulsa ūtrū atlasynuojumu, kas pyrmū reizi izraisa vīnu voi vairuokus AP.
Perforātuo plākstera konfiguriešona i analize. Veikt perforātu plāksteru īrokstu, izmontojūt standarta protokolus. Izmontoj pipeti bez ATP i GTP, kurā nav itaidys sastuovdalis: 128 mM glikonata K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0,1 mM EGTA i 2 mM MgCl2, i pīlāgoj pH 7,2 (izmontojūt KOH). ATP i GTP teik izlaisti nu intracelularuo škeiduma, kab nūvārstu nakontrolātu šyunu membranys caurlaideibu. Plāksteru pipeti pīpylda ar amfotericinu saturūšu īkšejū šķīdumu (apmāram 200 leidz 250 μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich), lai dabuotu perforātuo plākstera īrokstu. Amfotericins izšķīdynuoja dimetilsulfoksidā (gola koncentraceja: nu 0,1 leidz 0,3%; DMSO; D8418, Sigma-Oldrihs). Izmontuotajai DMSO koncentracejai nabeja nūzeimeigys ītekmis iz pieteitajim neironim. Perforiešonys procesa laikā tyka napuortraukti uzraudzeita kanala pretesteiba (Ra), i eksperiments tyka suokts piec Ra i AP amplitudys stabiliziešonuos (20-40 minotys). Spontanū aktivitati mierej sprīguma i/voi strāvys spailē 2 leidz 5 minotu garumā. Datu analize tyka veikta, izmontojūt Igora Pro (7.05.2 verseja, WaveMetrics, ASV), Excel (2010. goda verseja, Microsoft korporaceja, Redmonds, ASV) i GraphPad Prism (8.1.2. verseja, GraphPad programaturu Inc., Laholla, Kaliforneja). ASV). Kab identificātu spontanūs AP, teik izmontuots IgorPro NeuroMatic v3.0c spraudnis. Automatiski identificēt AP, izmontojūt nūteiktū slīksni, kas teik pīlāguots kotram īrokstam atseviški. Izmontojūt smailis intervalu, nūsoka smailis frekvenci ar maksimalū momentanū smailis frekvenci i videjū smailis frekvenci.
PN izolācija. Pīsalāgojūt īprīkš publicātajam protokolam, PN tyka atteireiti nu peļu mozūs smedziņu nūteiktā pūsmā (58). Īsuokumā mozūs smedziņus izdaleja i malte ladaini soltā disociacejis bareibā [bez HBSS Ca2+ i Mg2+, papyldynuoja ar 20 mM glikozi, penicilinu (50 V/ml) ​​i streptomicinu (0,05 mg/ ml) (0,05 mg/ ml) (0,05 mg/ ml) (1,05 mg/ml) bareibu sagremuoja [mgSSHB-12]. / ml), papainu (16 V / ml) un dezoksiribonukleazi I (DNāze I; 0,1 mg/ml)] Apstrōdoj 30 minūtis 30°C. Vysupyrma izmozgoj audus HBSS bareibā, kas satur olu gļūtys (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) i DNazi (0,1 mg/ml), ustobys temperaturā, kab nūvārstu enzimatiskū gramuošonu, i tod HBSS bareibā, kas satur 20 mM glikozi), Viegli slīcūt peniskajā HBlm5 (0,05 mg/ml) i DNaze (0,1 mg/ml) atbreivoj atseviškys šyunys. Īgiutū šyunu suspenseju filtrēja caur 70 μm šyunu sietnīku, tod šyunys granulēja centrifugejūt (1110 apgr./min., 5 minūtis, 4°C) i atkuortuoti suspendēja škieršonys bareibā [HBSS, papyldynuots ar 20 mM glikozi, 20% augļa gūvs stremicinu) Serumu, 5. (0,05 mg/ml)]; nūviertēt šyunu dzeivuotspieju ar propideja jodidu i pīlāguot šyunu bleivumu leidz 1×106 leidz 2×106 šyunom/ml. Pyrma plyusmys citometrejis suspenseja tyka filtrāta caur 50 μm šyunu sietnīku.
Plūsmas citometrs. Šyunu sakuortuošona tyka veikta 4°C, izmontojūt FACSAria III mašynu (BD Biozynuotnis) i FACSDiva programaturu (BD Biozynuotnis, 8.0.1 verseja). Šyunu suspenseja tyka sakuortuota, izmontojūt 100 μm sprauslu zam 20 psi spīdīņa ar uotrumu ~2800 nūtykumu/sek. Tai kai tradicionalī vārtu kritereji (šyunu izmārs, bimodaluo diskriminaceja i izkleisšonys eipašeibys) navar nūdrūsynuot pareizu PN izoliešonu nu cytu šyunu veidu, vārtu strategeja teik nūsaceita, bolstūtīs iz tīšu YFP intensitatis i autofluoresciešonys saleidzynuošonu mitoYFP+ ​​i kontrolis mitoYFP. YFP teik īrūsynuots, apstarojūt paraugu ar 488 nm lazera lineju, signals teik nūsaceits, izmontojūt 530/30 nm jūslys caurlaidis filtru. MitoYFP+ ​​pelei Rosa26-mitoYFP reportera gena relativū styprumu lītoj ari, kab atškiertu neironu kermeņa i aksonu fragmentus. 7-AAD teik sajiusmynuots ar 561 nm dzaltonu lazeru i nūsaceits ar 675/20 nm joslys caurlaideibys filtru, kab izslāgtu myrušuos šyunys. Kab vīnlaiceigi atdaleitu astrocitus, šyunu suspenseju īkruosuoja ar ACSA-2-APC, piec tuo paraugu apstaruoja ar 640 nm lazera lineju, signala nūsaceišonai izmontuoja 660/20 nm joslys caurlaideibys filtru.
Savuoktuos šyunys granulēja centrifugejūt (1110 apgr./min., 5 minutis, 4°C) i uzglobuoja -80°C leidz lītuošonai. Mfn2cKO pelis i tūs metīņa kuceni teik klasificāti vīnā dīnā, kab samazynuotu proceduralū maineibu. FACS datu prezentaceja i analize tyka veikta, izmontojūt FlowJo programmatūru (FlowJo LLC, Ašlenda, Oregona, ASV).
Kai pīmynāts īprīkš (59), realajā laikā PCR izmontoj, kab izolātu DNS nu sakuortuotūs neironu turpmuokai mtDNS kvantitativai nūsaceišonai. Linearitate i slīkšņa jiuteiba nu suokuma tyka puorbaudeita, izmontojūt qPCR iz vysaidu šyunu skaitu. Īsuokumā savuoc 300 PN lizis buferā, kas sastuov nu 50 mM tris-HCl (pH 8,5), 1 mM EDTA, 0,5% Tween 20 i proteinazis K (200 ng/ml) i inkubej 55°C 120 minūtis. Šyunys tuoļuok inkubēja 95°C 10 minutis, kab nūdrūsynuotu piļneigu proteinazis K inaktivizaceju. Izmontojūt mt-Nd1 rakstureigu TaqMan zondi (Thermo Fisher), mtDNS miereja ar puskvantitativu PCR 7900HT realajā laikā Ficientmošera PCR sistemā (Therific). Zynuotne, kataloga numurs Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Termo Fišera zynuotne, kataloga numurs AIVI3E8) i 18S (Termo Fišera zynuotne, kataloga numurs Hs99999901_s1) geni.
Proteomu parauga sagatavuošona. minutys karsejūt šķīdumu 95°C i ultraskaņojūt, lizis buferā [6 M guanidina hlorids, 10 mM tris (2-karboksietil) fosfina hidrohlorids, 10 mM hloracetamids i 100 mM tris- HC granulys sasaldātajā neironā]. Iz Bioruptora (Diagenoda) 10 minūtis (30 sekuņžu impulss / 30 sekuņžu pauzis periods). Paraugu atšķaideja 1:10 20 mM tris-HCl (pH 8,0), sajauca ar 300 ng tripsina zaltu (Promega) i inkubēja nakti 37°C, kab sasnāgtu piļneigu gramuošonu. Ūtrajā dīnā paraugu centrifugēja 20 000 g 20 minūtis. Supernatantu atšķaideja ar 0,1% mudskuobi, šķīdumu atsuoļuoja ar pošražuotim StageTips. Paraugu žāluoja SpeedVac instrumentā (Eppendorfa koncentrators plus 5305) 45°C, piec tam peptidu suspendēja 0,1% mudrskuobē. Vysus paraugus sagataveja vīnlaiceigi vīns i tys pats cylvāks. Kab analizātu astrocitu paraugus, 4 μg atsāļuotu peptidu markieja ar tandema masys marki (TMT10plex, kataloga numurs 90110, Thermo Fisher Scientific) ar peptidu i TMT reagentu attīceibu 1:20. TMT markiešonai 0,8 mg TMT reagenta tyka atkuortuoti suspendeiti 70 μl bezyudiņa ACN, i žāluotais peptids tyka atjaunuots 9 μl 0,1 M TEAB (trietilamonija bikarbonats), kam pīvīnuoja 7 μl TMT reagenta ACN. Koncentraceja beja 43,75%. Piec 60 minotu inkubacejis reakceju apslādz ar 2 μl 5% hidroksilamina. Markietī peptidi tyka savuokti, izkaļteiti, atkuortuoti suspendeiti 200 μl 0,1% mudrskuobis (FA), sadaleiti divejuos daļuos i piec tam atsauļdeiti, izmontojūt pošražuotūs StageTips. Izmontojūt UltiMate 3000 ultra augstvierteigu škidruo hromatografu (UltiMate 3000 ultra augstvierteigu škidruo hromatografa), vīna nu diveju pušu frakcionēja iz 1mm x 150mm Acquity hromatografejis kolonys, kas pīpiļdeita ar 130Å1,7μm C18 daleņom (Nr. Termo Fišera zynuotniskais). Atdaleit peptidus ar plyusmys ātrumu 30μl/min, atdaleit nu 1% leidz 50% bufera B 85 minotys ar pakuopenisku gradientu 96 minotys, nu 50% leidz 95% bufera B 3 minotys, tod 8 minotys 95 % bufera B; Bufers A ir 5% ACN i 10 mM amonija bikarbonats (ABC), bet bufers B ir 80% ACN i 10 mM ABC. Frakcejis savuoc ik piec 3 minotu i apvīnoj divejuos grupuos (1 + 17, 2 + 18 i c.) i žāloj vakuuma centrifugē.
LC-MS/MS analize. Masys spektrometrejai peptidi (skaitlis r119.aq) tyka atdaleiti iz 25 cm, 75 μm īkšejuo diametra UcoFrit analitiskuos kolonys (jauna objektiva lāca, dalis numurs PF7508250), kas aprīkota ar 1,9 μm ReproSil-Pur C1rse, 120 m. EASY-nLC 1200 (Termofišera zynuotniskais, Vuoceja). Kolona tyka uzturāta 50°C. Buferi A i B ir attīceigi 0,1% mudrskuobe iudinī i 0,1% mudrskuobe 80% ACN. Peptidi tyka atdaleiti ar pakuopenisku gradientu 200 nl/min nu 6% leidz 31% bufera B 65 minotys, i nu 31% leidz 50% bufera B 5 minotys. Eluātī peptidi tyka analizāti Orbitrap saplyusšonys masys spektrometrā (Termo Fišera zynuotnis). Peptidu prekursoru m/z mierejumu veic ar 120 000 izškiertspieju diapazonā nu 350 leidz 1500 m/z. Izmontojūt 27% normalizātū sadursmis energeju, augstys energejis C slazdu disociacejis (HCD) saškeļšonai teik izvālāts stypruokais prekursors ar luodeņa stuovūkli nu 2 leidz 6. Cykla laiks ir īstateits iz 1 s. Peptidu fragmenta m/z vierteiba tyka miereita jonu slazdā, izmontojūt mozuokū AGC mierķi 5×104 i maksimalū injekcejis laiku 86 ms. Piec sadrumstaluoteibys prekursors tyka īlykts dinamiskajā izsliegšonys sarokstā iz 45 s. Ar TMT markietī peptidi tyka atdaleiti iz 50 cm, 75 μm Acclaim PepMap kolonys (Termo Fišera zynuotnis, kataloga numurs 164942), migracejis spektri tyka analizāti iz Orbitrap Lumosa tribrida masys spektrometra (Termo Fišera zynuotnis augstveida masys spektrometrs). (FAIMS) īkuortys (Thermo Fisher Scientific) dorbojās pi diveju kompensacejis sprīgumu −50 i −70 V. TMT ziņuojuma jonu signala miereišonai izmontoj MS3, kas izvālāts, bolstūtīs iz sinhronizacejis prīškguojieju. Peptidu atdaleišona tyka veikta iz EASY-nLC 1200, izmontojūt 90% linearuo gradienta eluceju, ar bufera koncentraceju nu 6% leidz 31%; bufers A beja 0,1% FA, bet bufers B beja 0,1% FA un 80% ACN. Analitiskuo kolona dorbojās 50°C. Izmontojit FreeStyle (1.6. verseja, Thermo Fisher Scientific), lai sadaleitu suokūtnejū failu piec FAIMS kompensacejis sprīguma.
Ūlboltumvīlu identifikaceja i kvantitativa nūsaceišona. Izmontojūt integrātū Andromeda mekliešonys sistemu, suokūtnejī dati tyka analizāti, izmontojūt MaxQuant verseju 1.5.2.8 (https://maxquant.org/). Papyldu Cre rekombinazis i YFP sekveņcem, kas dabuotys nu Aequorea victoria, tyka meklāti peptidu fragmentu spektri peļu atsaucis proteoma (proteoma ID UP000000589) kanoniskuo sekveņce i izoformu sekveņce (Proteoma ID UP000000589), kas lejupluodāts nu UniProt 20. majā. Metionina oksidaceja i proteina N-terminaluo acetiliešona tyka nūteiktys kai maineigys modifikacejis; cisteina karbamoila metiliešona tyka nūteikta kai fiksātys modifikacejis. Gramuošonys parametri ir īstateiti iz “specifiskumu” i “tripsinu/P”. Minimalais peptidu i skūpstu peptidu skaits, kū izmontoj proteinu identifikacejai, ir 1; minimalais unikalu peptidu skaits ir 0. Peptidu karšu saskaņuošonys apstuokļūs proteina identifikacejis ruodeituojs beja 0,01. Ir īspējuota opceja “Ūtrais peptids”. Izmontojit opceju “atbiļsteiba storp palaisšonom”, kab veiksmeigys identifikacejis puornestu storp dažaidim originalī failim. Izmontuot LFQ minimalū attīceibys skaitu 1 bez markiejuma kvantitativai nūsaceišonai (LFQ) (60). LFQ intensitate teik filtrāta vysmoz divejom dereigom vierteibom vysmoz vīnā genotipa grupā kotrā laika punktā i teik ekstrapolāta nu normala sadalejuma ar plotumu 1. 0,3 i puorsavītuot iz leju 1,8. Izmontojūt Perseus skaitļuošonys platformu (https://maxkvant.net/perseus/) i R (https://r-projekts.org/), kab analizātu LFQ rezultatus. Diferencialuos izteiksmis analizei tyka izmontuots divvierzīņa videjais t tests nu limma programaturu (61). Izpietis datu analize teik veikta, izmontojūt ggplot, FactoMineR, faktoekstra, GGally i pheatmap. Iz TMT baļsteiti proteomikys dati tyka analizāti, izmontojūt MaxQuant verseju 1.6.10.43. Meklēt izejproteomikys datus nu UniProt cylvāka proteomikys datu bazis, kas tyka lejupluodāta 2018. goda septembrī, analizē īkļauts ražuotuoja snāgtais izotopu teireibys korekcejis faktors. Izmontuot limmu R diferencialuos izteiksmis analizei. Suokūtnejī dati, datu bazis mekliešonys rezultati i datu analizis dorba plyusma i rezultati vysi teik globuoti ProteomeXchange aliansē caur PRIDE partneru kruotivi ar datu kūpys identifikatoru PXD019690.
Funkcionaluos anotacejis boguotynoj analizi. Atjauteibys ceļa analizis (QIAGEN) reiks tyka izmontuots, kab nūsaceitu datu kūpys funkcionalūs anotacejis nūsacejumu boguoteibu 8 nedeļuos (1. att.). Īsuokumā kvantitativais proteinu saroksts, kas dabuots nu LC-MS/MS (tandema masys spektrometrejis) datu analizis, teik izmontuots ar itaidim filtra kriterejim: Mus musculus teik izvālāts par sugu i fonu, i kategorejā paruoda P vierteibu, kū Benjamini pīlāguoja boguotynuošonai 0,05 voi zamuoka, teik skaiteita par nūzeimeigu. Itam grafikam ir paruodeitys pīcys pyrmuokuos puormiereiguos kategorejis kotrā kūpā, bolstūtīs iz pīlāguotū P vierteibu. Izmontojūt vairuokus t-testus, izmontojūt Bendžamini, Krīgera i Jekutieli divpakuopu linearū uzlobuošonys programu (Q = 5%), kotrā kategorejā identificātajim svareigajim kandidatim teik veikta laika gaita proteina ekspresejis analize, i kotra rynda teik analizāta atseviški. Nav vajadzeibys pījimt konsekventu SD.
Kab saleidzynuotu ituo pietejuma rezultatus ar publicātom datu bazem i izveiduotu Venna diagramu 1. attālā, apvīnuojom kvantitativu proteinu sarokstu ar MitoCarta 2.0 anotacejom (24). Izmontojit tīšsaistis reiku Zeimēt Vena diagramu (http://bioinformatika.
Detalizātu informaceju par proteomikys analizei izmontuotajom statistikys procedurom, lyudzu, skaitit attīceigajā Materialu i metodu sadaļā. Par vysim puorejim eksperimentim detalizātu informaceju var atrast attīceigajā legendā. Ka nav nūruodeits cytaiži, vysi dati teik izsaceiti kai videjais ± SEM, i vysys statistikys analizis tyka veiktys, izmontojūt GraphPad Prism 8.1.2 programaturu.
Papyldu materialus itamā rokstā var atrast vītnē http://advances.sciencemag.org/cgi/saturs/pylns/35.6.
Tys ir atkluotys pīkļuvis roksts, kas izplateits saskaņā ar Creative Commons Attribution-Non-Commercial licences nūsacejumim, kas atļaun lītuot, izplateit i reproducēt sevkurā medejā, cikom gola izmontuošona nav komercialam lobumam i pījāmums ir tys, ka originaldorbs ir pareizs. Atsauce.
Pīzeime: Mes tikai lyudzam nūruodeit sovu e-posta adresu, lai cylvāks, kuru īsaceisi lopai, zynuotu, ka gribit, lai jis redz e-postu i ka tys nav spams. Mes naīgiusim nikaidys e-posta adresis.
Itys vaicuojums teik izmontuots, kab puorbaudeitu, voi esi apmaklātuojs i nūvārstu automatisku spama īsnīgšonu.
100 doc#1281 E. Motori, I. Atanasovs, S. M. V. Kočans, K. Folcs-Donahu, V. Saktivelu, P. Džavalisko, N. Toni, Dž. Pujals, N. G. Larsons
Disfunkcionalūs neironu proteomikys analize atkluoja, ka vīlmainis programys teik aktivizātys, kab nūvārstu neirodegeneraceju.
100 doc#1281 E. Motori, I. Atanasovs, S. M. V. Kočans, K. Folcs-Donahu, V. Saktivelu, P. Džavalisko, N. Toni, Dž. Pujals, N. G. Larsons
Disfunkcionalūs neironu proteomikys analize atkluoja, ka vīlmainis programys teik aktivizātys, kab nūvārstu neirodegeneraceju.
©2020 Amerikys Zynuotnis atteisteibys asociaceja. vysys tīseibys aizsorguotys. AAAS ir HINARI, AGORA, OARE, KORA, STUDŅUSS, KrystRef i SKAITEITUOJA partneris. Zynuotnis sasnāgumi ISSN 2375-2548.