Ūlboltumvīlu sakuortuošona sekrecejis ceļā ir nūzeimeiga, kab uzturātu šyunu nūdaleišonu i homeostazi. Papyldu čaulys mediātai sakuortuošonai lipidu lūma kinezinu sakuortuošonā sekrecejis transporta procesā ir ilggadejs pamatvaicuojums, iz kuru vēļ nav atbiļdāts. Ite mes veicam 3D vīnlaiceigu daudzkruosu augstys izškiertspiejis realajā laikā attāluošonu, kab pīruodeitu in vivo, ka naseņ sintezātī glikozilfosfatidilinozitola imobilizātī proteini ar cīši garom keramidu lipidu daļom teik sagrupāti i klasificāti specializātuos endoplazmuos piec transmbranys izejis vītys, kas ir. Bez tuo mes paruodom, ka keramida kēdis garums endoplazmys teikla membranā ir kritiskys itai sakuortuošonys selektivitatei. Myusu pietejums snādz pyrmūs tīšūs in vivo pīruodejumus, kab klasificātu proteinu kravys, bolstūtīs iz lipidu kēdis garumu, selektivuos eksporta vītuos sekrecejis ceļā.
Eikariotu šyunuos endoplazmys teiklā (ER) sintezātī proteini teik sakuortuoti transportiešonys laikā caur sekretoriskū ceļu, kab tyktu pīguoduoti atbylstūšajā šyunu golamierkī (1). Papyldu apvalka mediātai sakuortuošonai jau seņ tyka pījimts, ka nūteikti lipidi var kolpuot ari kai selektivī izejis punkti, sakūpojūt tūs nūteiktūs membranys domenūs, kas specifiski proteini (2-5). Tok vys vēļ tryukst tīšu pīruodejumu in vivo, kab pīruodeitu itū īspiejamū iz lipidim baļsteitu mehanismu. Kab atrysynuotu itū pamata problemu, mes raugūs pietejom, kai glikozilfosfatidilinozitola (GPI) īankurātī proteini (GPI-AP) teik atškireigi eksportāti nu ER. GPI-AP ir vysaidi ar lipidim saisteiti šyunu viersa proteini ( 6, 7). GPI-AP ir izdaleits proteins, kas pīstyprynuots plazmys membranys uorejom lapeņom caur glikolipidu daļu (GPI enkuru). Jī pījam GPI enkurus kai konservativys posttranslacejis izmainis ER lūmenā (8). Piec pīsavīnuošonys GPI-AP īt cauri Golgi aparatam (5, 9) nu ER iz plazmys membranu. GPI enkuru asameiba līk GPI-AP transportēt atseviški nu transmembranys izdaleitajim proteinim (tymā skaitā cytim plazmys membranys proteinim) pa sekrecejis ceļu (5, 9, 10). Rauga šyunuos GPI-AP teik atdaleiti nu cytu izdaleitūs proteinu endoplazmys teiklā i piec tam īpakāti unikaluos pūsmuos, kas īteiti ar apvalka proteinu kompleksu II (COPII) (6, 7). Ituo klasifikacejis procesa nūteicieji ER eksporta procesā nav skaidri, bet teik pījimts, ka itam mehanismam var byut vajadzeigi lipidi, eipaši GPI enkura lipidu dalis strukturaluo puorveiduošona (5, 8). Raugūs GPI lipidu puorveiduošona suocās izreiz piec GPI pīsavīnuošonys, i daudzūs gadīņūs tys līk keramidam sasaisteit ar 26 ūglekļa garūs kēdis pīsuotynuotū taukskuobi (C26:0) (11, 12). C26 keramids ir golvonais keramids, kū leidz šam ražoj rauga šyunys. Tys teik sintezāts ER i leluokuo daļa teik eksportāta iz Golgi aparatu caur COPII pūsmim (13). GPI-AP ER eksportam eipaši vajadzeiga pastuoveiga keramidu sinteze (14, 15), i sovukuort keramidu puorviersšona par inozitola fosfata keramidu (IPC) Golgi aparatā ir atkareiga nu GPI enkura sintezis (16). Biofiziskī pietejumi ar muoksleigajom membranom ir paruodejuši, ka cīši garys acila kēdis keramidi var apsavīnuot, veidojūt sakuortuotus domenus ar unikalom fiziskom eipašeibom (17, 18). Itī dati nūvad pi hipotezis, ka C26 keramids i GPI-AP ar C26 keramidu izmontoj sovys fizikaluos eipašeibys, kab apsavīnuotu sakuortuotūs regionūs voi regionūs saleidzynūši nateirā ER membranys lipidu vidē. Golvonūkuort tys sastuov nu īsu i napīsuotynuotu glicerolipidu (C16:1 i C18:1) (19, 20). Itī regioni tiks selektivi koncentrāti iz konkretom ER izejis vītom (ERES), kur keramidu i keramidu bazis GPI-AP var kūpā puorvītuot iz Golgi vīnā i tymā pošā specializātajā COPII pūsmā (5).
Itymā pietejumā mes asam tīši puorbaudejuši itū iz lipidim baļsteitu mehanismu, izmontojūt superizškiertspiejis konfokalū realajā laikā attāluošonys mikroskopeju (SCLIM), kas ir modernuokuo mikroskopejis metode, kas var vīnlaiceigi nūvāruot fluoresciejūši markietus šyunu proteinus Treiskruosu i treisdimenseju lipelu izškiertspiejis i treisdimenseju extreme in) (21., 22.).
Mes nu suokuma izmontuojom SCLIM tehnologeju, kab tuoļuok nūsaceitu, kai normals GPI-AP ar C26 keramidu grupu tyka puorbaudeits nu transmembranu izdaleitūs proteinu piec atstuošonys ER S. cerevisiae. Kab puorbaudeitu ER klasifikaceju, mes izmontuojom genetiskū sistemu, kas var tīši vizualizēt jaunsintezātū kravu, kas īīt ERES in vivo (7, 23). Kai kravu mes izavieliejom iz C26 keramida bazis GPI-AP Gas1, kas markiets ar zaļu fluoresciejūšū proteinu (GFP) i transmembranys izdaleitū proteinu Mid2, kas markiets ar tyvai infrasorkonū fluoresciejūšū proteinu (iRFP), kas obeji ir mierķtieceigi iz plazmys membranu (24–26). sec31-1 temperaturys jiuteigajā mutantā ituos divejis kravys teik izsaceitys zam galaktozi inducejama promotora i konstitutiva ERES markera. Ekstremalajā temperaturā (37°C), partū ka sec31-1 mutaceja ītekmej COPII apvalka komponenta Sec31 funkceju, kab nūmīrynuotu COPII deigtspieju i ER eksportu, ER uzakruoj jaunsintezātuo krava (23). Piec atdzisšonys leidz zamai temperaturai (24°C) sec31-1 mutantuos šyunys atsaveseļuoja nu sekrecejis zonys, i uzkruotū jaunū sintetiskū kravu suoce eksportēt nu ER. CLIM vizualizaceja paruodeja, ka leluokuo daļa jaunsintezātūs Gas1-GFP i Mid2-iRFP vys vēļ uzakruoja sec31-1 mutantu šyunu ER piec inkubacejis 37°C i piec tam atbreivoj 24°C 5 minotys (1. att.). Tai kai Mid2-iRFP ir izplateits pa vysu ER membranu, i Gas1-GFP ir koncentrāts i savuokts puortrauktajā ER membranys apgobolā, tūs sadalejums ir piļneigi cytaids (1. att., A leidz C i Movie S1). Bez tuo, kai paruodeits 1D attālā, Gas1-GFP kūpā nav Mid2-iRFP. Itī rezultati nūruoda, ka GPI-AP i transmembranys proteini tyka agri sadaleiti dažaidūs ER membranys regionūs. Gas1-GFP kūpa ir sūpluok specifiskam ERES, kas markiets ar mCherry COPII apvalka proteinu Sec13 (1. att., E i F, i kina S1) (23).
šyunys ekspresej galaktozis izraiseituos sekrecejis, garu acilkēdis (C26) keramidu GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, zaļš) i puormembranys proteinu Mid2-iRFP (TMP, zylu) i itei konstruktivuo ERES markiešona Sec13-mCherry, 30. minotu, puorvītuots iz 24°C, i attāluots ar SCLIM piec 5 minotu. (A leidz C) paruoda reprezentativu apvīnuotu voi vīnu 2D plaknis attālu (A), 10 z-sekceju 2D projekcejis attālu (B) voi kravys i ERES markeru 3D šyunu puslūdis attālu (C). Mārūga josla 1μm (A un B). Mārūga vīneiba ir 0,551μm (C). Gas1-GFP tyka konstatāts atseviškūs ER regionūs voi kūpuos, bet Mid2-iRFP tyka konstatāts i izplateits pa vysu ER membranu (C). (D) Grafikā paruodeita Gas1-GFP i Mid2-iRFP relativuo fluoresciešonys intensitate Gas1-GFP kūpā gar boltū bultu lineju (pa kreisi). AU, pošvaleiga vīneiba. (E i F) attāloj 3D attālu, kas apvīnoj preci i ERES zeimi. Gas1-GFP kūpys tyka konstatātys pi specifiskuos ERES. Mārūga vīneiba ir 0,551μm. (F) Boltuo cīta bulteņa apzeimoj Gas1-GFP kūpu, kas saisteita ar ERES. Vyds i lobajā panelī radzams apvīnuotais palelynuotais 3D attāls i izvālātuos Gas1-GFP kūpys rotāts skots.
Cīšuos telpiskuos attīceibys storp Gas1-GFP kūpu i konkretu ERES nūruoda, ka Gas1-GFP var īīt selektivā ERES, kas atsaškir nu selektivitatis, kū izmontoj Mid2-iRFP, kab atstuotu ER. Kab rysynuotu itū īspieju, mes kvantitativi nūviertējom ERES attīceibu tikai vīnai voi divejom precem (2. att., A leidz C). Konstatējom, ka leluokajā daļā ERES (70%) ir tikai vīna veida kravys. 2C attāla apakšejā attālā radzami diveji tipiski ERES pīmāri ar tikai Gas1-GFP (1. att.) voi tikai Mid2-iRFP (2. att.). Sovukuort apmāram 20% ERES satur divejis kravys, kas puorsakluoj vīnā apgobolā. Tyka konstatāts, ka dažūs ERES (10%) beja diveju veidu kravys, bet tuos tyka izolātys skaidri atškireiguos vītuos. Partū itei statistiskuo analize paruoda, ka piec ER eksportiešonys GPI-AP Gas1-GFP i transmembranys kravys Mid2-iRFP teik sadaleitys dažaiduos ERES (2D att.). Itei sakuortuošonys efektivitate cīši atbylst īprīkšejai biokimiskajai analizei (6) i morfologiskajai nūsaceišonai (7). Varam nūvāruot ari karantinys kravys uzvedeibu, kas īīt ERES (2. att. E i filma S2). 2E attālā radzams, ka tikai nalela daļa Gas1-GFP (3. paneļs) voi Mid2-iRFP (4. paneļs) īīt ERES nu vīnys pusis i ir īrūbežuota atseviškā apgobolā. 2E attāla 5. panelī radzams, ka Gas1-GFP i Mid2-iRFP cytu reizi atrūnami vīnā i tamā pošā ERES, bet tī īīt nu dažaidom pusem i ir koncentrāti atseviškūs regionūs, kas var puorstuovēt dažaidus COPII pūsmus. Mes ari apstyprynuojom, ka nūvāruotuo C26 keramidu bazis GPI-AP Gas1 kai selektivuo ERES atdaleišona i klasifikaceja ir specifiska, partū ka cyta transmembranys sekrecejis kravys, GFP markiets plazmys membranys proteins Axl2 (27 ), paruoda leidzeigu uzvedeibu kai Mid2-iRFP. (Attāls S1 i Filma S3). Tikū sintezātais Axl2-GFP teik izplateits cauri ER membranai, par pīmāru, Mid2-iRFP (S1, A i B attāls), i leluokajā daļā ERES ir lokalizāts kūpā ar Mid2-iRFP (S1, B leidz D attāls). attāla 1. i 2. panelī S1C paruodeiti diveji tipiski ERES pīmāri, kur puorsakluoj divejis transmembranys kravys. Itaidūs gadīņūs obejis precis īīt ERES kūpā (S1E att., 3. paneļs i S3 filma).
100 doc#1281 Sec31-1 šyunys, kas ekspresej galaktozis izraiseituos sekrecejis, Gas1-GFP (GPI-AP, zaļš) i Mid2-iRFP (TMP, zyls) i konstitutivuo ERES markiešona Sec13-mCherry (ERES, purpureigais) tyka īlyktys 37 Piec inkubacejis iz °C leidz 30 minotom. bloks, i attāls ar SCLIM piec 20 minotu. (nu A leidz C) Reprezentativi 2D projekcejis attāli (A; mārūga jūsla, 1μm) voi 3D šyunu puslūdis attāli (B i C; mārūga vīneiba, 0,456μm) nu kravys i 10 z-sekcejom, kas apzeimuotys ar ERES. Apakšejā panelī (B) i panelī (C) paruoda apstruoduotus attālus, kab paruodeitu tikai precis, kas ir ERES (purpureigs) [Gas1-GFP (pelēks) i Mid2-iRFP (gaiši zyls)]. (C) Atvārta bulteņa: ERES nas tikai vīnu kravys gabaleņu (1 leidz 4). Pelēka bulteņa: ERES ir segregāta krava (5). Bolta cīta bulteņa: ERES, kas satur kūpā izvītuotu kravu. Zamuok: Izvālātajā vīnā ERES satur tikai Gaz1-GFP (1) voi Mid2-iRFP (2). Mārūga josla, 100 nm. (D) (C) apraksteituo fotomikrografejis kvantitativa nūsaceišona. Videjais ERES procents, kas satur tikai vīnu kravu (Gas1-GFP voi Mid2-iRFP), segregātu kravu i puorsakluojūšu kravu. Treis naatkareigūs eksperimentūs n=432 54 šyunuos. Klaidu josla = SD. Divpuseigs napuorīts t tests. *** P = 0,0002. (E) 3D attāls nu karantinys kravys atlaseitys ERES, kas apzeimuotys ar (C). Gas1-GFP (zaļš) (3) voi Mid2-iRFP (zyls) (4) īīt ERES (purpureigs) nu vīnys pusis i ir īrūbežuots nalelā plateibā ERES ītvorūs. Reizem obeji kravys veidi īīt vīnā ERES (5) nu vīnys i tuos pošys pusis i teik īrūbežuotys izolātā apgobolā ERES ītvorūs. Mārūga josla, 100 nm.
Piec tuo mes puorbaudejom hipotezi, ka ER membranā asūšais garais acila kēdis keramids (C26) veicynoj Gas1 specifiskū sakūpuošonu i sakuortuošonu selektivā ERES. Itam mierkim mes izmontuojom modificātu rauga calmu GhLag1, kurā divejis endogenuos keramidu sintazis Lag1 i Lac1 tyka aizstuotys ar GhLag1 (kūkvylnys Lag1 homologs), kuo rezultatā tyka izveiduots rauga calms ar šyunu membranys Ceramida calmu, kas ir eisuoks par sovvalis tipu (3. att. A) (2). Masys spektrometrejis (MS) analize paruodeja, ka savvalis tipa calmūs 95% nu kūpejuo keramida ir cīši gars (C26) kēdis keramids, bet GhLag1 85% keramida ir cīši gars (C18 i C16). ), tikai 2% keramida ir cīši gara (C26) kēdis keramida. Koč i C18 i C16 keramidi ir golvonī keramidi, kas leidz šam atkluoti GhLag1 membranā, MS analize ari apstyprynuoja, ka GhLag1 calmā ekspresātais Gas1-GFP GPI enkurs satur C26 keramidu, kas ir saleidzynojams ar sovvalis tipa lipidim. Kvalitate ir tei poša (3. att. A) (26). Partū tys nūzeimoj, ka keramidu puorveiduošonys enzims Cwh43 ir cīši selektivs pret C26 keramidu, kai paruodeits 26. attālā, tys prīškrūku dūd GPI enkuru nu nalela daudzuma C26 keramida GhLag1 calmā. S2 (29). Tok GhLag1 šyunu membranā pamatā ir tikai C18-C16 keramids, bet Gas1-GFP vys vēļ ir C26 keramids. Itys fakts padora itū calmu par idealu reiku, kab eipaši atrysynuotu membranys keramida acila kēdis garuma problemu ER. Klasis i sakuortuošonys hipotetiskuo lūma. Piec tam mes pyrmū reizi pietejom C26 Gas1-GFP spieju uzakruot kūpuos GhLag1 ar temperaturai jiuteigu sec31-1 mutantu aleli, izmontojūt parostū fluoresciešonys mikroskopeju, kur ER membranys ceramidā pastuov tikai gara (C18-C16) kēde (3. att.). Mes nūvāruojom, ka sec31-1 leluokuo daļa Gas1-GFP beja koncentrāta kūpuos, bet Gas1-GFP sec31-1 GhLag1 ar garu (C18-C16) garu keramida ER membranu golvonūkuort nabeja sakūpuota i izplateita Vysā ER membranā. Precizuok, tai kai iz C26 keramidu baļsteituo sakūpuošona ir cīši saisteita ar specifisku ERES (1. att.), mes tuoļuok pietejom, voi itys process var īkļaut ari ER eksporta proteina mehanisma funkceju. GPI-AP izmontoj eipašu COPII sistemu ER eksportam, kū aktivi regulej Ted1′s GPI enkura glikanu dalis strukturaluo puorveiduošona (30, 31). Piec tam rekombinantū GPI-glikanu atpazeist transmembranu kravys receptoru p24 komplekss, kas sovukuort selektivi pīsaista Lst1, kas ir specifiska golvonuos COPII kravys saistūšuos apakšvīneibys Sec24 izoforma, veidojūt ar GPI-AP boguotu COPII pūsmu (33). Deļtuo mes izveiduojom dubultū mutantu, kas apvīnuoja itūs atseviškūs proteinu (p24 kompleksa komponenta Emp24, GPI-glikana puorveiduošonys enzims Ted1 i specifiskuo COPII apakšvīneiba Lst1) izsliegšonu ar sec31-1 mutantu calmu, i pietejom tūs Voi ir īspiejams veiduot GFP1-clu3 att.). Mes nūvāruojom, ka sek31-1emp24Δ i sek31-1ted1Δ Gas1-GFP golvonūkuort ir nasagrupāts i izplateits pa vysu ER membranu, kai īprīkš radzāts sek31-1 GhLag1, bet sek31-1lst1Δ, Gas1-GFP Kai sek3. Itī rezultati nūruoda, ka kluotyn C26 keramida kluotbyutnei ER membranā Gas1-GFP sakūpuošonai ari ir vajadzeigs sasaisteit ar p24 kompleksu, i tam nav vajadzeiga specifiska Lst1 pīsaiste. Piec tuo mes pietejom īspieju, ka keramida kēdis garums ER membranā var regulēt Gas1-GFP saisteibu ar p24. Tok mes atkluojom, ka C18-C16 keramida kluotbyutne membranā naītekmej p24 kompleksa rekonstruātūs GPI-glikanus (S3 i S4, A i B attāli) voi saisteibu ar GPI-AP i GPI-AP eksportiešonu. spieja. Vervēt COPII apakštipu Lst1 (S4C attāls). Deļtam nu C26 keramidu atkareigajai sakūpuošonai nav vajadzeiga proteinu sovstarpeiguo īdarbeiba ar dažaidim ER proteinu eksporta mehanismim, bet atbolsta alternativu sakuortuošonys mehanismu, kū veicynoj lipidu garums. Piec tam mes analizējom, voi keramidu acila kēdis garums ER membranā ir svareigs Gas1-GFP kai selektivuo ERES efektivai klasifikacejai. Tai kai Gas1 GhLag1 calmā ar īsuos kēdis keramidu atstuoj ER i īīt plazmys membranā (S5 att.), mes skaitam, ka, ka sakuortuošonu vierzej keramida acila kēdis garums, Gas1 GhLag1 calmā var puorvierzeit i krystuot. ERES preces ar taidu pošu membranu.
(A) GhLag1 šyunu membranā golvonūkuort ir eisuoki C18-C16 keramidi, bet Gas1-GFP GPI enkuram vys vēļ ir taids pats C26 IPC kai savvalis tipa šyunom. Augšuok: keramida acila kēdis garuma analize sovvalis tipa (Wt) i GhLag1p calmu šyunu membranā ar masys spektrometreju (MS). Dati attāloj kūpejuo keramida procentuali. Treis naatkareigu eksperimentu videjais. Klaidu josla = SD. Divpuseigs napuorīts t tests. **** P <0, 0001. Apakšejais paneļs: MS analize par IPC acila kēdis garumu, kas atsarūn Gas1-GFP (GPI-IPC) GPI enkurā, kas izsaceits savvalis tipa i GhLag1p calmūs. Dati attāloj kūpejuo IPC signala procentu. Videjais pīcu naatkareigu eksperimentu. Klaidu josla = SD. Divpuseigs napuorīts t tests. ns, nav svareigi. P = 0,9134. (B) Sec31-1, sek31-1 GhLag1, sek31-1emp24Δ, sek31-1ted1Δ un sek31-1lst1Δ šyunu fluorescēšonas mikrografejis, kas ekspresej galaktozis izraiseitu Gas1-GFP, tyka inkubētas lejā 37°C 30°C un 30 minotu garumā. piec 24°C. Boltuo bulteņa: ER Gaz1-GFP kūpa. Atvārta bulteņa: Nasakūpuota Gas1-GFP ir izplateita iz vysys ER membranys, paruodūt ER rakstureigū kūdulgradzyna kruosu. Mārūga josla, 5μm. (C) (B) apraksteituo fotomikrografejis kvantitativa nūsaceišona. Videjais šyunu procents ar punktātu Gas1-GFP strukturu. Treis naatkareigūs eksperimentūs n≥300 šyunu. Klaidu josla = SD. Divpuseigs napuorīts t tests. **** P <0, 0001.
Kab tīši atrysynuotu itū problemu, mes veicem Gas1-GFP i Mid2-iRFP SCLIM vizualizaceju GhLag1 ar sec31-1 temperaturai jiuteigū mutantu aleli (4. att. i S4 kina). Piec tam, kod ER tyka saglobuots 37°C i piečuok atbreivuots 24°C, leluokuo daļa naseņ sintezātuo Gas1-GFP natyka sakūpuota i izplateita pa vysu ER membranu, kai tū nūvāroj ar parostajim mikroskopim (4. att., A i B ). Bez tuo lels ERES procents (67%) ītver diveju veidu kravys, kas tymā kūpā atsarūn (4. att. D). 4C attāla 1. i 2. panelī paruodeiti diveji tipiski ERES pīmāri ar puorsakluošonu Gas1-GFP i Mid2-GFP. Bez tuo obejis precis tyka pījimtys dorbā vīnā ERES (4. att. E, 3. paneļs i filma S4). Deļtuo myusu rezultati nūruoda, ka keramidu acila kēdis garums ER membranā ir svareigs ER proteinu agregacejis i klasifikacejis nūteiciejs.
Sec31-1 GhLag1 šyunys, kas ekspresej galaktozis izraiseituos sekrecejis, Gas1-GFP (GPI-AP, zaļš) i Mid2-iRFP (TMP, zyls) i sastuovdaļu ar ERES markietū Sec13-mCherry (ERES, purpura) Inkubej 37°C. Turpynoj 30 minotys, nūlaiž leidz 24°C, lai atbreivuotu sekrecejis, i attāloj ar SCLIM piec 20 minotu. (nu A leidz C) Reprezentativi 2D projekcejis attāli (A; mārūga jūsla, 1μm) voi 3D šyunu puslūdis attāli (B i C; mārūga vīneiba, 0,45μm) nu 10 z-sekcejom, kas apzeimuotys ar kravu i ERES. Apakšejā panelī (B) i panelī (C) paruoda apstruoduotus attālus, kab paruodeitu tikai precis, kas ir ERES (purpureigs) [Gas1-GFP (pelēks) i Mid2-iRFP (gaiši zyls)]. (C) Bolta pīpiļdeita bulteņa: ERES, preces puorsakluoj. Atvārta bulteņa: ERES ir tikai vīns punkts. Apakšejais paneļs: Izvālātajam ERES ir puorsakluojūšys precis (1 i 2), kas apzeimuotys (C). Mārūga josla, 100 nm. (D) (C) apraksteituo fotomikrografejis kvantitativa nūsaceišona. sec31-1 i sec31-1 GhLag1 vīneibuos ir īkļauta tikai vīna krava (Gas1-GFP voi Mid2-iRFP), i videjais ERES procents izolātai kravai i puorsakluojūšai kravai. Treis naatkareigūs eksperimentūs n = 432 54 šyunuos (sek31-1) i n = 430 47 šyunuos (sek31-1 GhLag1). Klaidu josla = SD. Divpuseigs napuorīts t tests. *** P = 0, 0002 (31.-1. punkts) un ** P = 0, 0031 (31.-1. punkts). (E) 3D attāls nu izlaseitys ERES ar puorsakluojūšu kravu (3), kas apzeimuots (C). Gas1-GFP (zaļš) i Mid2-iRFP (zyls) tyvojās ERES (purpureiga) nu vīnys i tuos pošys pusis i palīk vīnā ERES īrūbežuotajā zonā. Mārūga josla, 100 nm.
Itys pietejums snādz tīšus pīruodejumus in vivo, ka iz lipidu bazis proteinu kravys teik klasificātys selektivuos eksporta vītuos sekrecejis ceļā i atkluoj acila kēdis garuma nūzeimi klasifikacejis selektivitatei. Izmontojūt spieceigu i modernuokū mikroskopejis metodi, kū sauc par SCLIM, mes demonstrējom naseņ sintezātū Gas1-GFP (golvonuo plazmys membranys GPI-AP ar cīši garu acila kēdi (C26) keramidu lipidu daļu) raugūs ) Regioni, kas sakūpuoti atseviškūs transmbramu proteinūs, ir saisteiti ar 100 doc#1281 . ER membranu (1. att.). Bez tuo itī diveji preču veidi īīt atškireigūs ERES selektivi (2. att.). Šyunu keramida acila kēdis garums membranā teik samazynuots nu C26 leidz C18-C16, Gas1-GFP kūpa teik izjaukta atseviškā ER regionā, i Gas1-GFP teik puorvierzeits, kab atstuotu ER ar transmembranys proteinu caur tū pošu ERES (3. att. i 3. att.). 4).
Koč i GPI-AP izmontoj specializātu proteina mehanismu, kab izītu nu ER, mes atkluojom, ka nu C26 keramidu atkareiguo atdaleišona naatkareiga nu atškireigu proteinu sovstarpeigū darbeibu, kas var nūvest pi ERES specializacejis (S4 i S5 attāli). Tuo vītā myusu atkluojumi atbolsta alternativu klasifikacejis mehanismu, kū veicynoj iz lipidim baļsteiti proteinu sakūpuošona i tam sekojūša cytu kravu izsliegšona. Myusu nūvāruojumi nūruoda, ka Gas1-GFP regionā voi kūpā, kas saisteits ar konkretu ERES, tryukst transmembranys izdaleituo proteina Mid2-iRFP, kas nūruoda, ka nu C26 keramidu atkareigais GPI-AP kūpa atvīgluos tūs īīšonu attīceigajā ERES, i tymā pošā laikā, izslādz itū konkretū transmembranu The 2). Sovukuort C18-C16 keramidu kluotbyutne ER membranā naizraisa GPI-AP regionu voi kūpu veiduošonūs, partū tī naizslādz voi naaizstuoj transmembranys izdaleitūs proteinus tymā pošā ERES (3. i 4. att.). . Deļtam mes īrūsynojam, ka C26 keramids veicynoj atdaleišonu i klasifikaceju, atvīglojūt proteinu sakūpuošonu, kas saisteita ar specifisku ERES.
Kai sasnēgt itū nu C26 keramidu atkareigū sakūpuošonu konkretā ER apgobolā? Membranys keramida tendeņce atdaleitīs iz suonim var izraiseit GPI-AP i C26 keramidu mozu i momentāni sakuortuotu lipidu veiduošonūs ER membranys naregularuokā lipidu vidē, kas satur eisuokus i napīsuotynuotus glicerolipidus. Kvalitatis kūpys (17, 18). Ituos mozuos pagaidu kūpys var vēļ vaira sapludynuot leluokuos, stabiluokūs kūpuos piec sasaisteišonys ar p24 kompleksu (34). Atbylstūši tam mes paruodejom, ka C26 Gas1-GFP vajag sovstarpeigū darbeibu ar p24 kompleksu, kab veiduotu leluokus radzamus kūpus (3. att.). p24 komplekss ir heterozigots oligomers, kas sastuov nu četru dažaidu p24 transmembranu proteinu raugūs (35), kas nūdrūsynoj daudzvierteigu saisteibu, kas var izraiseit mozu GPI-AP kūpu sasaisteišonu, taidā veidā rodūt leluoku stabilu kūpu (34). GPI-AP proteinu ektodomenu sovstarpeiguo īdarbeiba var veicynuot ari tūs agregaceju, kai tys ir paruodeits Golgi transportiešonys laikā zeideituoju polarizātuos epitela šyunuos (36). Tok, kod ER membranā ir C18-C16 keramids, kod p24 komplekss saistuos ar Gas1-GFP, naizaveiduos lelys atseviškys kūpys. Pamatā asūšais mehanisms var byut atkareigs nu garuos acila kēdis keramida specifiskūs fiziskūs i kimiskūs eipašeibu. Muoksleigūs membranu biofiziskī pietejumi paruoda, ka koč i gon gari (C24), gon eisi (C18-C16) acilkēdis keramidi var izraiseit fazu atdaleišonu, tikai gari acilkēdis keramidi (C24) var veicynuot augstu izlīkumu i plēvis līkumu, kab puorveiduotu plēvi. Caur sovstarpejū atsauci (17, 37, 38). Ir pīruodeits, ka TMED2, Emp24 cylvāka homologs, transmembranuo spirale selektivi sovstarpeigai īsadorboj ar C18 keramidu bazis sfingomielinu citoplazmys lūceitovuos (39). Izmontojūt molekularuos dinamikys (MD) simulacejis, mes atkluojom, ka gon C18, gon C26 keramidi uzakruoj ap Emp24 transmembranys spiralis citoplazmys lūceitovom, i jim ir leidzeigys prīškrūceibys (S6 att.). Ir vārts pīzeimēt, ka tys nūruoda, ka Emp24 transmembranuo spirale var izraiseit asimetrisku lipidu sadalejumu membranā. Tys ir jauns rezultats, kas baļsteits iz zeideituoju šyunom. Leidzeigys MD simulacejis paruoda ari etera lipidu kluotbyutni (40) . Partū mes spekulej, ka C26 keramids divejuos ER26 lūceitovuos ir lokali boguotynuots. 100 doc#1281 Kod GPI-AP luminaluos lūceitovuos taišni saistuos ar daudzvierteigū p24 i C26 keramida uzakruošonu ap p24 citoplazmys lūceitovuos, tys var veicynuot leidza asūšū Ūlboltumvīlu agregaceju i membranys izlīkums teik radeits caur pierstim (41), līkūt GPI-AP ari favorly atdaleit diskreju adja regionā. ER membranys apgobolūs (42). Īprīkšejī ziņuojumi atbaļsteja īrūsynuotū mehanismu (43, 44). Oligolektinu, patogenu voi antivīlu daudzvierteiguo saisteiba ar keramidu bazis glikosfingolipidim (GSL) iz plazmys membranys izraisa lelu GSL agregaceju, uzloboj fazu atdaleišonu i izraisa membranys deformaceju i internalizaceju (44). Iwabuči i c.
Zīduotuoju polarizātajuos epitela šyunuos anti-Golgi teikla (TGN) koncentraceja apikaluos plazmys membranys leiminī kontrolej GPI-AP atdaleišonu i sakuortuošonu (10, 45). Itū agregaceju veicynoj GPI-AP oligomerizaceja (36), bet tys var byut atkareigs ari nu keramidu kēdis garuma, kū mes atrūnam raugūs. Koč ari zeideituoju GPI-AP ir etera lipidu bazis enkurs, i tuo kimiskuo struktura ir cīši atškireiga nu cīši garuos acila kēdis keramida, nasenejā pietejumā atkluots, ka obejim lipidim ir evolucionari leidzeigys fizikaluos i kimiskuos eipašeibys I funkceja (40). Deļtam etera lipidu daļa zeideituoju šyunuos var byut leidzeiga C26 keramidam raugūs, i tuo lūma ir sasaisteit ar garūs kēdis keramidu membranā, kab veicynuotu GPI-AP agregaceju i sakuortuošonu. Koč i itei īspieja vys vēļ ir tīši juopuorbauda, ​​īprīškejī atkluojumi apstyprynoj, ka garuos acila kēdis keramida transportiešonu iz Golgi kermini naveic citoplazmys puornesšonys proteini, bet gon ir atkareiga nu GPI enkuru, par pīmāru, raugu, sintezis. Partū evolucejis konservativais mehanisms, ruodīs, var selektivi kūpā transportēt cīši garu acilkēdis keramidu i GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) vīnā transporta pūsmā.
Raugu i zeideituoju polarizātuos epitela šyunu sistemuos GPI-AP agregaceja i atdaleišona nu cytu plazmys membranys proteinu nūteik pyrma šyunu viersa sasnīgšonys. Paladino i c. (48) atkluoja, ka iz zeideituoju polarizātūs epitela šyunu TGN GPI-AP sakūpuošona ir vajadzeiga na viņ GPI-AP selektivai klasifikacejai iz apikalū plazmys membranu, bet ari regulej GPI-AP sakūpuošonys organizaceju i tuos biologiskū aktivitati. Šyunu viersma. Raugūs itys pietejums paruodeja, ka nu C26 keramidu atkareigais GPI-AP kūpums iz ER var regulēt GPI-AP kūpu organizaceju i funkcionalū aktivitati iz plazmys membranys (24, 49). Atbylstūši itam modeļam GhLag1 šyunys ir alergiskys pret GPI inhibitorim voi zuolem, kas ītekmej šyunu sīnu integritati (28), i vajadzeiba piec funkcionalu Gas1-GFP kūpu (49) nu gola keramida, kas projicāts rauga šyunu puoruošonā, nūruoda iz G Īspiejamom hLag šyunu fiziologiskajom sekom. GPI-AP klaida. Tok tuoļuoka puorbaude, voi šyunu viersa funkcionaluo organizaceja ir īprogrammāta nu ER ar sakuortuošonys metodi, kurys pamatā ir lipidu garums, byus myusu turpmuokūs pietejumu temats.
Itymā dorbā izmontuotī Saccharomyces cerevisiae calmi ir uzskaiteiti S1 tabulā. SCLIM MMY1583 i MMY1635 calmi dzeivūs šyunu attāluošonai tyka izveiduoti iz W303 fona. Itī calmi, kas ekspresej Sec13-mCherry ar fluoresciejūšu proteina marku, tyka izveiduoti, izmontojūt iz polimerazis kēdis reakcejis (PCR) baļsteitu metodi ar pFA6a plazmidu kai veidni (23). Calms, kas ekspresej Mid2-iRFP, kas markiets ar fluoresciejūšū proteinu GAL1 promotora kontrolē, tyka izveiduots tai. 100 doc#1281 IRFP-KanMx sekveņcis PCR amplifikaceja nu pKTiRFP-KAN vektora (E. O'Šī duovona, Addgene plazmidys numurs 64687; Piec tuo, kai Mid2-iRFP genoma sekveņce tyka pastiprynuota i klonāta GAL1 promotorā, tei tyka integrāta integracejis plazmidys pRS306 Not I-Sac I vītā. Dabuotuo plazmida pRGS7 tyka linearizāta ar Pst I, kab integrātu URA3 lokusā.
Gas1-GFP saplyusšonys gens teik ekspresāts GAL1 promotora kontrolē centromera (CEN) plazmidā, kas ir konstruāta tai. Gas1-GFP sekveņci pastyprynuoja ar PCR nu pRS416-GAS1-GFP plazmidys (24) (L. Popolo duovona) i klonēja CEN plazmidys pBEVY-GL LEU2 (C duovona) Xma I–Xho I vītā. Millers; Pīvīnuojuma plazmidys numurs 51225; 100 doc#1281 51225; RRID: Papyldynuojums_51225). Dabuotū plazmidu nūsauce par pRGS6. Axl2-GFP saplyusšonys gens teik izsaceits ari pBEVY-GL LEU2 vektora GAL1 promotora kontrolē, tuo konstrukceja ir taida. Axl2-GFP sekveņce tyka pastiprynuota nu pRS304-p2HSE-Axl2-GFP plazmidys (23) ar PCR i klonāta pBEVY-GL LEU2 vektora Bam HI-Pst I vītā. Dabuotuo plazmida tyka nūsaukta par pRGS12. Itymā pietejumā izmontuotūs oligonukleotidu seceiba ir uzskaiteita S2 tabulā.
Calmu papyldynuoja ar 0,2% adeninu i 2% glikozi [YP-dekstrozi (YPD)], 2% rafinozi [YP-rafinozi] boguotu rauga ekstrakta proteina p (YP) bareibu (1 % rauga ekstrakts i 2% proteina ept). (YPR)] voi 2% galaktozis [YP-galaktozis (YPG)] kai ūglekļa olūts, voi sintetiskā minimalajā vidē (0,15% rauga sluopekļa bāze i 0,5% amonija sulfats), kab papyldynuotu atbylstūšys aminoskuobis i bāzis, kas vajadzeigys uzturvierteibai , I satur 2% sinthetejis minimalū glikozi2 (sintetiskuo galaktozis minimaluo bareiba) kai ūglekļa olūts.
Attāluošonai realajā laikā temperaturai jiuteiguos sec31-1 mutantuos šyunys, kas ekspresej konstrukceju zam GAL1 promotora, audzeja YPR bareibā 24°C nakti leidz vyds log fazei. Piec indukcejis YPG 24°C 1 stuņdi, šyunys inkubēja SG 37°C 30 minutis, piec tam puornese iz 24°C, kab atsabreivuotu nu sekrecejis bloka. Konkanavalinu A izmontuoja, kab fiksātu šyunys iz stykla slīdis i attāluotu ar SCLIM. 100 doc#1281 SCLIM ir Olympus IX-71 apgrīztuos fluoresciešonys mikroskopa i UPlanSApo 100×1,4 skaitliskuos atvāruma eļlis objektiva (Olympus), uotrūs i augstuos signala-trūkšņa attīceibys rotejūšuo disku konfokaluo skenera (Yokogawa Electric i pīlāguots spektrometra), pīlāguots spektrometrs (Hamamacu fotonika) var nūdrūsynuot palelynuotuoja objektivu sistemu ar gola palelynuojumu ×266,7 i ar luodeņu savīnuotu īreicis kameru, kas reizynoj elektronus (Hamamacu fotonika) (21). Attālu īgivi veic pīlāguota programatura (Yokogawa Electric). 3D attālim mes izmontuojom piec pasyutejuma izgataveitu pjezoelektriskū izpiļdmehanismu, kab vertikali vibrātu objektivu objektivu, i optiskuos dalis savuocem 100 nm attuolumā kaudzeitē. Z-steka attāls teik puorveiduots par 3D vokseļu datim, teoretiskū punktu izplateibys funkceju, kū izmontoj rotejūšajam disku konfokalajam mikroskopam, izmontoj dekonvolucejis apstruodei ar Volocity programaturu (PerkinElmer). Izmontojūt Volocity programaturu, kab automatiski nūsaceitu slīksni kūpvītys analizei, tyka miereits ERES, tymā skaitā kravys. Lineju skeniešonys analize tyka veikta, izmontojūt MetaMorph programaturu (molekularuos īreicis).
Izmontojūt GraphPad Prism programmatūru, kab nūsaceitu statistiskū nūzeimi. Divpuseigajam Studenta t-testam i parostajam vīnvierzīņa dispersejis analizis (ANOVA) testam teik skaiteits, ka atškireibom storp grupom ir byutiska ītekme iz P <0, 05 (*).
Gas1-GFP fluoresciešonys mikroskopejai logfazis šyunys audzeja nakti YPD i savuoce centrifugacejā, divejis reizis izmozguoja ar fosfatu buferātu suoļa šķīdumu i inkubēja iz lada vysmoz 15 minutis, piec tam turpynuoja zam mikroskopa, kai apraksteits īprīšk (Check24). Īgiušonai tyka izmontuots Leica DMi8 mikroskops (HCX PL APO 1003/1,40 eļļa PH3 CS), kas aprīkots ar objektivu, L5 (GFP) filtru, Hamamatsu fotoaparatu i pīlītuojumu komplektu X (LAS X) programmatūru. .
Paraugi tyka denaturāti ar SDS parauga buferi 65°C 10 minotys, piec tam atdaleiti ar SDS-poliakrilamida gela elektroforezi (PAGE). Imunoblotiešonys analizei iz vīnu jūslu īkruove 10 μl parauga. Primaruo antivīla: izmontoj trušu poliklonalū anti-Gas1 atškaideišonā 1:3000, trušu poliklonalū anti-Emp24 atškaideišonā 1:500 i trušu poliklonalū anti-GFP (H. Rizmana duovona) atškaideišonā 1:3000. Peļu monoklonalū anti-Pgk1 antivīlu izmontuoja atškaideišonā 1:5000 (Dž. de la Krusa duovona). Sekundaruo antivīla: mārceņu peroksidazis (HRP) konjugātais kozu prettrušu imunoglobulins G (IgG), kū lītoj atšķaideišonā 1:3000 (Pīrss). HRP konjugātū kozu antipeļu IgG izmontuoja atšķaideišonā 1:3000 (Pīrss). Imunreakcejis zonu nūvāruoja ar SuperSignala Rītumu Piko reagenta (Thermo Fisher Scientific) kimiluminiscencis metodi.
Kai apraksteits (31), iz bogotynuotuos ER frakcejis tyka veikts dabisks imunoprecipitacejis eksperiments. Īsuokumā rauga šyunys izmozgoj ar TNE buferi [50 mM tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM fenilmetilsulfonilfluora i proteazis inhibitora maisejumu) 600 nm ( OD600 densitisks) 100 divreiz. Tū salauze ar stykla krellim, tod šyunu atkrytumus i stykla krellis nūjēme ar centrifugaceju. Piec tuo supernatantu centrifugēja 17 000 g 15 minotys 4°C. Granulys atkuortuoti suspendēja TNE i pīvīnuoja digitalis saponinu leidz gola koncentracejai 1%. Suspenseju inkubēja 1 stuņdi ar rotaceju 4°C, piec tam naškeidynojūšuos sastuovdalis nūjēme centrifugejūt 13 000 g 4°C 60 minotys. Gas1-GFP imunūguļsniešonai nu suokuma īprīkš inkubej paraugu ar tukšom agarozis krellim (ChromoTek) 4°C 1 stuņdi, piec tuo inkubej ar GFP-Trap_A (ChromoTek) 4°C 3 stuņdis. Imunoprecipitātuos krellis tyka pīcys reizis izmozguotys ar TNE, kas satur 0,2% digoksigenina, eluātys ar SDS parauga buferi, atdaleitys iz SDS-PAGE i analizātys ar imunoblotiešonu.
Kai apraksteits (31), škārssaistis nūsaceišona tyka veikta iz bogotynuotuos ER frakcejis. Eisuok sokūt, bogotynuotū ER frakceju inkubēja ar 0,5 mM ditiobisu (sukcinimidila propionatu) (Pīrss, Thermo Fisher Scientific, Rokforda, IL, ASV; 20°C, 20 min). Saiknis reakceja tyka apslāgta, pīvīnojūt glicinu (50 mM gola koncentraceja, 5 minutis, 20°C).
Kai apraksteits īprīkš (50), tyka veikta keramidu MS analize sovvalis tipa i GhLag1 calmūs. Īsuokumā šyunys audzeja leidz eksponencialajai fazei (3 leidz 4 OD600 vīneibys/ml) YPD 30°C, tyka īvuoktys 25×107 šyunys. Tūs metabolisms teik apslāgts ar trihloretiķskuobi. Izmontoj ekstrakcejis škeidynuotuoju [etanolu, iudini, eteru, piridinu i 4,2 N amonija hidroksidu (15:15:5:1:0,018 v/v)] i 1,2 nmol īkšejuo standarta C17 keramida (860517, Avanti polarais lipids) kvalitatis). Izmontoj monometilamina reagentu [metanolu, iudini, n-butanolu i metilamina šķīdumu (4:3:1:5 v/v)], kab veiktu ekstrakta vīglu sārmainu hidrolizi, i tod izmontoj iudinī pīsuotynuotu n-butanolu atsāļuošonai. Gols golā ekstrakts tyka atkuortuoti suspendeits pozitivuo režima škeidynuotuojā [hloroforms/metanols/iudiņs (2:7:1) + 5 mM amonija acetats] i īlykts masys spektrometrā. Sfingolipidu molekulu identifikacejai i kvantitativai nūsaceišonai tyka veikta daudzu reakceju uzraudzeiba (MRM). TSQ Vantage trešuo kvadrupola masys spektrometrs (Thermo Fisher Scientific) ir aprīkots ar robotiskū nanoplyusmys jonu olūtu Nanomate HD (Advion Biosciences, Itaka, Ņujorka) lipidu analizei. Sadursmis energeja ir optimizāta kotrai keramidu kategorejai. MS dati tyka īgiuti pozitivā režimā. Kotram biologiskajam atkuortuojumam lipidu signals ir treju naatkareigu mierejumu videjais.
Kai apraksteits (31), šyunys (800×107), kas ekspresej Gas1-GFP, tyka pakļautys dabiskai imunoprecipitacejai. Atteireitū Gas1-GFP atdaleja ar SDS-PAGE i puornese iz polivinilidena fluorida (PVDF) membranu. Proteinu vizualizēja, kruosojūt PVDF ar amida malnū. Gas1-GFP jūsla tyka izgrīzta nu PVDF i 5 reizis izmozguota ar metanolu i vīnu reizi ar škidruos hromatografejis-MS (LC-MS) kvalitatis iudini. 100 doc#1281 Inkubejūt membranys jūslu ar 500 μl 0,3 M NaOAc (pH 4,0), buferu i 500 μl svaigi izškeist 1 M glukozita inozita maisejumu 37°C 3 stuņdis, lipidu frakceja teik atbreivuota nu Gas1-GFP i lizētais inofaza atbreivuots (51). Piec tuo membranys jūslu četrys reizis izmozguoja ar LC-MS kvalitatis iudini, izkolta ustobys temperaturā i uzglobuoja sluopekļa atmosferā -80°C leidz analizei. Kai kontroli kotram eksperimentam tyka izmontuots tukšs PVDF membranys paraugs. Piec tam nu Gas1-GFP izjimtī lipidi tyka analizāti ar MS, kai apraksteits (50). Īsuokumā PVDF jūslys, kas satur GPI-lipidu, tyka atkuortuoti suspendeitys 75μl nagativā pelējuma škeidynuotuojā [hloroforms/metanols (1:2) + 5 mM amonija acetats] i izlaists elektrosmiļkšu jonizaceja (ESI)-MRM/MS sfingolipidu sugu analize (TSQ Vantage). Itymā gadīnī MS dati tyka īgiuti nagativūs jonu režimā.
Kai jau īprīkš pīmynāts, GPI enkura lipidu daļa tyka atdaleita nu [3H]-inozitola markietuo GPI-AP (16). Lipidus atdaleja ar pluonsluoņa hromatografeju, izmontojūt škeidynuotuoja sistemu (55:45:10 hloroforms-metanols-0,25% KCl) i vizualizāti, izmontojūt FLA-7000 (Fujifilm).
Šyunys, kas ekspresej Gas1-GFP (600×107), tyka divejis reizis izmozguotys ar TNE buferi ar TNE buferi, salauztys ar stykla krellim, piec tuo centrifugātys, kab nūjimtu šyunu atkrytumus i stykla krellis. Piec tuo supernatantu centrifugēja 17 000 g 1 stuņdi 4°C. Granulys izmozguoja TNE i inkubēja ar 1 V PI-PLC (Invitrogen) TNE, kas satur 0,2% digitalis saponinu 1 stuņdi 37°C. Piec enzimu apstruodis membranu nūjēme centrifugejūt 17 000 g 4°C 1 stuņdi. Kab nūguļsnētu Gaz1-GFP, supernatantu inkubēja ar GFP-Trap_A (ChromoTek) 4°C nakti. Atteireitais Gas1-GFP, kas atdaleits ar SDS-PAGE, tyka īkruosuots ar Coomassie spylgtu zylu. Gas1-GFP kruosuošonys jūsla tyka nūgrīzta nu pelēkuo, kas apjam akveduktu, piec tam piec alkiliešonys ar jodacetamidu i redukcejis ar ditiotreitolu tyka veikta gela gramuošona ar tripsinu. Izjimt i izkaļteit triptiskūs peptidus i peptidus ar GPI-glikanim. Žāluotū peptidu izškeidynoj 20 μl iudiņa. Īlīk porceju (8μl) LC. Peptidu atdaleišonai nūteiktūs gradienta apstuokļūs izmontuoja oktadecilsilana (ODS) kolonu (Develosil 300ODS-HG-5; īkšejais diametrs 150 mm×1,0 mm; Nomura Chemical, Aiči prefektura, Japana). Mobiluo faze ir škeidynuotuojs A (0,08% mudrskuobe) i škeidynuotuojs B (0,15% mudrskuobe 80% acetonitrilā). Izmontuoja Accela HPLC sistemu (Thermo Fisher Scientific, Bostona, Masačusetsa), kab 55 minotu laikā kolonu ar škeidynuotuoju A eluātu ar plyusmys uotrumu 50 μl min-1 5 minotys, piec tam škeidynuotuoja B koncentraceju palelynuoja leidz 40%. , ASV). Eluatu napuortraukti īvīse ESI jonu olūtā, triptiskūs peptidus i peptidus ar GPI-glikanim analizēja ar LTQ Orbitrap XL (hibridu linearuo jonu slazdu-orbitrapys masys spektrometru; Thermo Fisher Scientific). MS uzstuodeišonā kapilara olūta sprīgums tyka īstateits iz 4,5 kV, bet puornesšonys kapilara temperatura tyka uzturāta 300°C. Kapilaru sprīgums i caurulis objektiva sprīgums tyka īstateiti attīceigi iz 15 V i 50 V. MS dati tyka īgiuti pozitivuos jonu režimā (izškiertspieja 60 000; masys precizitate 10 dalis iz miļjonu) masys diapazonā 300/m/z masys/luodeņa attīceibys (m/z) 3000. sadursmis izraiseituo disociaceja (CID)].
MD simulacejis tyka veiktys, izmontojūt GROMACS (52) programmatūru i MARTINI 2 spāka lauku (53-55). Piec tuo CHARMM GUI membranys veiduotuojs (56, 57) tyka izmontuots, kab izveiduotu divsluoni, kas satur dioleoilfosfatidilholinu (DOPC) i Cer C18 voi DOPC i Cer C26. Cer C26 topologeja i koordinatis teik dabuotys nu DXCE, nūjamūt papyldu krellis nu sfingozina astis. Izmontojit zamuok apraksteitū procesu, kab īleidzynuotu dubultū sluoni i palaistu tū, tod izmontojūt sistemys pādejuos koordinatis, kab izveiduotu sistemu, kurā ir Emp24. Rauga Emp24 transmembranais domens (atlykumi nu 173. leidz 193.) tyka izveiduots kai α-spirale, izmontojūt vizualū MD (VMD) reiku molekularū strukturu (58). Piec tuo piec puorsakluojušūs lipidu nūjimšonys proteins tyka rupji granulāts i īlykts divsluonī, izmontojūt CHARMM GUI. Pādejā sistemā ir 1202 DOPC i 302 Cer C26 voi 1197 DOPC i 295 Cer C18 i Emp24. Jonizej sistemu leidz koncentracejai 0,150M. Div divsluoņu kompozicejom tyka izgataveiti četri naatkareigi atkuortuojumi.
Lipidu divsluoņs teik leidzsvoruots, izmontojūt CHARMM GUI procesu, kas īkļaun 405 000 sūļu samazynuošonu i piec tam leidzsvoruošonu, kur pozicejis īrūbežuojumi teik pamozom samazynuoti i likvidāti, i laika sūļs teik palelynuots nu 0,005 ps leidz 0,02 ps. Piec leidzsvora tys ražoj 6 μs ar laika sūli 0,02 ps. Piec Emp24 īlikšonys izmontoj tū pošu CHARMM GUI procesu, kab samazynuotu i leidzsvoruotu sistemu, i tod 8 s ražuošonā palaiž.
Vysom sistemom leidzsvora procesa laikā spīdīni kontrolej Berendsena barostats (59), bet ražuošonys procesa laikā spīdīni kontrolej Parinello-Rahmana barostats (60). Vysūs gadīņūs videjais spīdīņs ir 1 bārs i teik izmontuota pusizotropiskuo spīdīņa savīnuošonys shema. Leidzsvora i ražuošonys procesā izmontoj termostatu (61) ar uotruma puorkalibraceju, kab attīceigi savīnuotu proteina, lipidu i škeidynuotuoja daleņu temperaturu. Vysys darbeibys laikā mierķa temperatura ir 310K. Nasaisteišonys sovstarpeigū darbeibu apriekinoj, izveidojūt puorīšonys sarokstu, izmontojūt Verleta shemu ar 0,005 bufera toleraņci. Kulona terminu apriekinoj, izmontojūt reakcejis lauku i rūbežattuolumu 1,1 nm. Vandera Vaalsa terminā teik izmontuota nūgrīzšonys shema ar nūgrīzšonys attuolumu 1,1 nm, i Verleta nūgrīzšonys shemu izmontoj potencialajai nūvierzei (62).
Izmontojūt VMD, rūbežviļņa garums storp DOPC fosfata krellim voi keramida AM1 krellim i proteinu ir 0,7 nm, teik apriekinuots lipidu skaits, kas sovstarpeigai īsadorboj ar proteinu. 100 doc#1281 Saskaņā ar šaidu formulu apriekinoj nūplyusšonys-boguotynuošonys (DE) koeficientu kai (63): DE koeficients = (kūpejū lipidu daudzums proteinā 0,7) proteinā 0,7 (Cer daudzums kūpejūs lipidūs) .
Ziņuotuo vierteiba teik dabuota kai videjuo, i klaidu jūslys ir četrys naatkareigys SE kopejis. DE faktora statistiskū nūzeimi apriekinoj ar t testu [(videjaisDE-faktors-1)/SE]. Apriekinojit P vierteibu nu vīnpuseiguo sadalejuma.
GROMACS reiks tyka izmontuots, kab apriekinuotu sistemys 2D suonu bleivuma karti, kas satur Emp24 pādejūs 250 ns nu pāda. Kab dabuotu keramida boguotynuošonys/nūplyusšonys karti, Cer bleivuma karti dola ar Cer i DOPC kartis summu, i tod dola ar Cer koncentraceju organismā. Izmontoj tū pošu kruosu kartis mārūgu.
Papyldu materialus itamā rokstā var atrast http://advances.sciencemag.org/cgi/saturs/pylns/50.6.
Tys ir atkluotys pīkļuvis roksts, kas izplateits saskaņā ar Creative Commons Attribution-Non-Commercial licences nūsacejumim, kas atļaun lītuot, izplateit i reproducēt sevkurā medejā, cikom gola izmontuošona nav komercialam lobumam i pījāmums ir tys, ka originaldorbs ir pareizs. Atsauce.
Pīzeime: Mes tikai lyudzam nūruodeit sovu e-posta adresu, lai cylvāks, kuru īsaceisi lopai, zynuotu, ka gribit, lai jis redz e-postu i ka tys nav spams. Mes naīgiusim nikaidys e-posta adresis.
Itys vaicuojums teik izmontuots, kab puorbaudeitu, voi esi apmaklātuojs i nūvārstu automatisku spama īsnīgšonu.
Sofija Rodrigesa-Galjardo, Kazuo Kurokava, Susana Sabido-Bozo, Alehandro Kortess · Gomezs (Alehandro Kortess-Gomezs), Acuko Ikeda (Acuko Ikeda), Valerija Zoni (Valerija Zoni), Auksiliadora Agilera-Romero, Ana Marija Lohope -Linero), Vaga), Misako Armana (Misako Armana), Mijako Rimana (Mijako Rimana), Prova Akira, Stefano Fanija, Akihiko Nakano, Manuels Munizs
3D augstys izškiertspiejis attāluošona realajā laikā atkluoj keramidu kēdis garuma nūzeimi proteinu sakuortuošonai selektivuos izvadis vītuos.
Sofija Rodrigesa-Galjardo, Kazuo Kurokava, Susana Sabido-Bozo, Alehandro Kortess · Gomezs (Alehandro Kortess-Gomezs), Acuko Ikeda (Acuko Ikeda), Valerija Zoni (Valerija Zoni), Auksiliadora Agilera-Romero, Ana Marija Lohope -Linero), Vaga), Misako Armana (Misako Armana), Mijako Rimana (Mijako Rimana), Prova Akira, Stefano Fanija, Akihiko Nakano, Manuels Munizs
3D augstys izškiertspiejis attāluošona realajā laikā atkluoj keramidu kēdis garuma nūzeimi proteinu sakuortuošonai selektivuos izvadis vītuos.
©2020 Amerikys Zynuotnis atteisteibys asociaceja. vysys tīseibys aizsorguotys. AAAS ir HINARI, AGORA, OARE, KORA, STUDŅUSS, KrystRef i SKAITEITUOJA partneris. Zynuotnis sasnāgumi ISSN 2375-2548.