Paļdis, ka apmeklejot Nature.com.Pōrlūka versejai, kuru lītojat, ir īrūbežōts CSS atbolsts.Lai īgyutu lobōkū pīredzi, īsacejam izmontōt atjaunōtu pōrlūku (voi izslēgt sadereibas režimu Internet Explorer).Pa tū laiku, lai nūdrūšynōtu turpynōtu atbolstu, mes parōdeisim sātys lopu bez stilim un JavaScript.
Atškireibā nu mugorkaulinīku teik skaiteits, ka kukainim tryukst veirīšu aizsprīdumu dzimtis steroidu hormonu. ūlu atteisteiba i puoruošonuos ir byutiskys reproduktivuos īzeimis, saprūtūt, kai Anopheles ūdu sīvītis integrej itūs hormonalūs signalus, varātu atvīgluot jaunu malarejis kontrolis programu izstruodi.Ite mes atkluojam, ka ituos reproduktivuos funkcejis regulej atškireigi dzymuma steroidi caur sarežgeitu ekdisteroidu aktivizejūšūs enzimu teiklu. oksidēts ekdizons, 3-dehidro-20E (3D20E), kas aizsargoj vacuokus, slādzūt sīvīšu seksualū uztvereibu piec seksualuos puornesšonys i aktivizejūt ar defosforolizi. sīvīšu atvasynuotais 20E naizraisa seksualu reakceju, bet ļaun puoruošonuos individim likt olas piec 20E inhibejūšūs kinažu nūmīriešonys.Ituo veirīšu specifiskuo kukaiņu steroidu hormona identifikaceja i tuo lūma sīvīšu seksualuos receptivitatis reguliešonā ar P malareju puornosuotuoju ūdu reproduktivī panuokumi.
Otkon pīaug malarejis gadīni i nuovis gadīni4, deļtuo ka Anopheles ūdi, vīneigais cylvāka malarejis parazitu puornosuotuojs, ir plaši izplateita insekticidu rezistence.Itūs ūdu puoruošonuos biologeja ir eipaši atraktivs mierkis jaunom malarejis kontrolis īsajaukšonom, partū ka sīvītis puoruojās tikai vīnu reizi5; padareit itū vīnu puoruošonuos nūtykumu sterilu, byutu lels potencials samazynuot uodu populacejis laukā.
Sīvītis palīk seksuali navareigys piec augsta titra steroidu hormonu sajimšonys nu veirīšu.Pietejumi ir paruodejuši, ka gryuteibu izraiseituojs tuoļuokā puoruošonā ir 20-hidroksiekdizons (20E), steroidu hormons, kas lobuok pazeistams kai pūsteišonys cykla regulators kūneņu stadejā, kas ir specifiskuos puorvītuošonys E2. Anopheles sugys, kas ir daļa nu apakšgiņts Cellia7, kas ir izplateita Afrikā i īkļaun vysbeistamuokūs malarejis puornosuotuojus, tymā skaitā Anopheles gambiae.Tys ir eipaši vārts pīzeimēt, partū ka itamuos suguos ari muoteitis ražoj 20E piec kotrys ašņa iedīņreizis, i 20E dzyna dzeiveibu reHoogenecy apmāram. kurā sīvītis integrej signalus nu diveju dažaidu ekdizona olūtu (veirīšu puornesšona i ašņa barošonys indukceja), naapdraudūt sovys puoruošonuos spiejis.Patīseibā, ka sīvīšu radeitais 20E izraisa seksualū naiļdzeibu, tys nūvess pi naaugleibys neapstruodojūšim individim, kas ir cīši izplateita uzvedeiba in5.
Īspiejams skaidruojums ir tys, ka A. gambiae tieveņi puornas modificātu tieveņam rakstureigu ekdizonu, kas aktivizej signalizācejis kaskadu sīvīšu reproduktivajā traktā, kuo rezultatā roduos puoruošonuos nastabilitate. steroidi nav konstateiti kukaiņūs.
Mes izdūmuojom nūsaceit steroidu hormonu repertuaru seksuali nūbrīdušu A. gambiae veirīšu veirīšu pīdareigūs dzīdzeri (MAG), meklejūt īspiejamūs modificejūšūs steroidus.Izmontojūt augstys veiktspējys škidruos hromatografejis kūpā ar tandema masys spektrometreju (HPLC-MS/MS), navys mozuok specifiskū metodi (ecdysviE2). itymā audā, apstyprynojūt īprīkšejū rezultatu.Tūmār paraugā dominēja oksidāti fosforilāti steroidi, kas atbylst formulai 3-dehidro-20E-22-fosfats (3D20E22P)12 (1. att.).Cytys formys ir 3-dehidro-20E)20E (1. att.). (20E22P).3D20E22P HPLC-MS/MS signala intensitate beja par divejom leluma kuortom augstuoka par tuo defosforilātū formu, 3D20E, i par treis leluma kuortom augstuoka par E i 20E (1. att.).Koč ari cytuos kermeņa daļuos; 1a).Mes ari analizējom ekdisteroidus tikū slāgtim (<1 dīnu vacim) veirīšim i sīvītem i atkluojom 3D20E i 3D20E22P tikai MAG; E, 20E un 20E22P beja obejūs dzymumūs (Paplašynuotī dati 1.b att.).Itī dati līcynoj, ka A. gambiae pīaugušī tieveņi sovuos MAG ražoj augstus modificejūšūs hormonu titrus, kurus nasintezej sīvītis.
100 doc#1281 MAG un sīvīšu LRT (tymā skaitā prīkšstoti, sāklu pūsmi un parovarijs) tyka izdaleiti nu 4 dīnas vacim (4 dīnas vacim) neapstruoduotom tievenim un neapdzeivōtom un pōrōtom sīvītem (0,5, 3 un 12 zs/min). atkluošonys līmenis (FDR) korigāts; NS, nav nūzeimeigs; *P <0,01 .3D20E: 3 stuņdis pret 0,035; 3D20E22P: 3 stuņdis pret 0,5 stuņdem, P = 0,25; 12 stuņdis pret 3 stuņdem, P = 0,0032; 12 stuņdis pret 0,5 stuņdem, P = 0,015).Dati ir nu treju biologiskūs atkuortuojumu skaits. uodi.Ekdizons teik attāluots ar kruosu tai: E, zaļš; 20E, oranžs; 20E22P, violets; 3D20E, zyls; 3D20E22P, ružovs.Īliktnis palelynoj mārūgu iz y-ass, lai paruodeitu zamuoku ekdizona leimini.
Kab izpieteitu, voi 3D20E22P i 3D20E teik puornastys puoruošonuos laikā, mes izškeirem sīvīšu LRT dažaidūs laika punktūs piec puoruošonuos.Koč ari ekdizons natyka konstateits jaunavom, mes nūvāruojom īvārojamu 3D20E22P daudzumu decreting LRT (izreiz piec h5ma-0m). laiks, bet 3D20E leimiņs īvārojami pīauga (1. att.).Izmontojūt kimiski sintezātū 3D20E kai standartu, mes nūsacejom, ka ituo steroidu hormona leimiņs puorvītuošonys LRT beja vysmoz 100 reizis augstuoks par 20E (Paplašynuotī dati 1. tabula).Taitod, ma 3D2ons ir the2dys E. sīvīšu LRT puoruošonuos laikā, i tuo defosforilātuo forma 3D20E palīk cīši boguoteiga dreiži piec puoruošonuos.Tys līcynoj par pādejuo ekdizona svareigu lūmu sīvīšu piecpuoruošonuos biologejā.
Piec jaunys RNS sekvenciešonys (RNS-seq) datu kūpys izveiduošonys (2.a att.), izmontojūt piec pasyutejuma izveiduotu bioinformatikys cauruļvodu, mes mekliejom ekdizona kinazi (EcK), ekdizona oksidazi (EO) i ekdizona, kas kodej 20E modificātū fosfatazis kandidatu identificētū reproducejūšū genā.EPP) EPP gens i diveji potencialī EcK geni (EcK1 i EcK2), bet navarēja atrast lobu kandidatu EO genu.Pīzeimoj, ka atseviški EPP geni tyka izsaceiti augstā leiminī (98,9. procentils) Gambejis MAG, bet na sīvīšu LRT (2. att. b). šū sīvīšu audu.Deļtuo mes skaitam, ka veirīšu EPP var tikt puornasts puoruošonuos laikā.Eistineibā, mes izmontuojom in vivo stabilu izotopu markiešonu, kab maskētu sīvīšu proteinu piec puoruošonuos, enzimu, kū identificēja MS sīvīšu atrijā (2. att. c i papyldu tabula beja MRT ari mafema) apstyprynuots, izmontojūt specifiskys antivīlys (2. att. d).
a, Piec pasyutejuma izveiduots bioinformatikys cauruļvads, kab kotra dzymuma reproduktivajūs audu meklētu genus, kas kodej EcK, EO i EPP.Skaitli sūpluok bultom nūruoda veirīšu i sīvīšu kandidatu skaitu kotrā sūlī (Itei analize identificēja vīnu EPPE genu i exKE) veirīši, i vīns EcK gens (EcK2), kas ir ekspresāts obejūs dzymumūs, bet naīdūd kandidatu EO genu.b, Syltuma karte, kas saleidzynoj kandidatu genu ekspreseju jaunūs (V) i puoruošonuos (M) Anopheles gambiae i Anopheles albicans auduos.Spca, apaugļuošona; MAG, pīdaru dzīdzeri veirīšim; cytys kermeņa dalis, tymā skaitā kryušu, spuornu, kuojis, tauku kermini, i īkšejūs organus obejūs dzymumūs, i olnīkus sīvītem.EcK2 ir cīši izteikts gon Gambijis MAG, gon atrijā, bet EPP atrūnams tikai MAG.c, Proteomiskuo analize veirīšu ejakulatu grupā at2. hpm, paruodūt 67 vysboguotuokūs proteinus.Muoteitis tyka audzynuotys iz uzturu, kas satur 15N, lai markietu (i maskātu) vysus proteinus.Namarkietī tieveņi tyka puoruoti ar markietom muoteitem, i sīvīšu LRT tyka izdaleiti 3, 12 i 24 hpm proteomiskajai supplementarijai analizei a1. proteini).Inset, EPP, Eck1 un EcK2 tyka konstateiti jaunūs veirīšu MAG ar šūs audu proteomisku analizi.d, EPP tyka konstateits ar western blotu MAG un LRT puorvītōtūs sīvīšu, bet na jaunūs sīvītēs voi veirīšūs voi pōrejōs sīvīšu antimembranas kontroles un simultac probed) anti-EPP antivīlys.Vysi veirīši ir jauni.Skatīt papyldu 1. attālu par gela olūta datim.Western blots tyka veikti divejis reizis ar leidzeigim rezultatim.
EPP ekdisteroidu fosfosfatazis aktivitate tyka puorbaudeita piec inkubacejis ar HPLC-MS/MS ar 3D20E22P, kas izolāts nu MAG (Paplašynuotī dati 2.a att.). (3. att. a), i sīvītem, kas puoruotys ar EPP apklusynuotim tievenim, beja nūzeimeiga A mozuoka defosforilātuo 3D20E proporceja (3. att. b), nasaverūt iz daleju genu klusynuošonu (Paplašynuotī dati 2b, c att.).Sovukuort mes naatkluojom nūzeimeigys izmainis saP/E,20 attīceibā. līcynoj, ka enzims ir specifisks 3D20E22P (3. att. b).
a, Samazynuota fosfatazis aktivitate MAG, kū izraisa EPP klusynuošona, izmontojūt dubultvērtinis EPP RNS (dsEPP) voi dubultvērtinis GFP RNS (dsGFP) kontrolis.Kotrā atkuortuojumā tyka izmontuoti divdesmit MAG baseini (P = 0, 0046, Feles puorvītuoti t-test, Feles puorvītuoti ar t-test. puoruotim ar EPP apklusynuotim tievenim beja īvārojami mozuoka defosforilātuo 3D20E daļa 3 ZS (P = 0, 0043, napuoreits t-tests, divpuseigs), bet 20E leimiņs nabeja ītekmāts (P = 0, 063, napuoreits). t-tests, divpuseigs).Dati ir paruodeiti kai videjais ± sem nu treis baseinu ar 13, 16 i 19 sīvītem kotrā.c, Muoteitem, kas puoruotys ar EPP apklusynuotim tievenim, beja īvārojami augstuoki atkuortuotys puoruošonuos ruodeituoji (P = 0, 0002, Fišera precizais puoruošonuos tests to ensureemales to divpuseigs). Piec 2 dīnom jī tyka sasazynuoti ar cytim tievenim, kuri nese transgenū spermu, kab nūvārtātu atkuortuotuos puoruošonuos ruodeituojus, izmontojūt transgena kvantitativu PCR nūsaceišonu.d, Ar ašni barojamom muoteitem, kas puoruotys ar EPP apklusynuotim tievenim, beja īvārojami samazynuota augleiba (P < 0, 0001; Mann-Whitney skaits samazynuots) tests, 0,088, Manna-Vitnija tests, divpuseigs) , bet nārsta ātrums natyka ītekmāts (P = 0,94, Fišera precizais tests, divpuseigs).Vysūs paneļūs n apzeimoj biologiski naatkareigu ūdu paraugu skaitu.NS, nav nūzeimeigs.*P < **P <0,0,05. ****P <0, 001.
Tuoļuok mes nūviertējom, voi ekdizona defosforoliešona ir svareiga, kab izraiseitu puoruošonuos rezistenci muoteitem.Pīzeimoj, ka muoteitis, kas puoruojās ar EPP-depleted tievenim, atkuortuoti puoruojās daudz leluokā bīžumā (44,9%) nakai kontrolis muoteitis (10,4%), kod tyka pakļautys papyldu (transgenajam). augleiba (3d att., pa kreisi) un nalels šūs muoteišu īlyktūs olu skaita sasamazynōjums (3d att., vydā), bet sīvīšu īlyktūs olu procents (vēļ vīna atbiļde, kas izraiseita sīvītēs ar pōruošonu )) natyka ītekmāta (3d att., šōs rezultats).Given the observity ofP2. līcynoj, ka 3D20E aktivacejai ar EPP, kas puornas puoruošonuos laikā, var byut svareiga lūma sīvīšu uztvereibys izslāgšonā pret tuoļuoku puoruošonu, uzvedeibu, kas īprīkš tyka attīcynuota iz 20E seksualū puornesšonu .Partū itys veirīšu specifiskais hormons ari stypri ītekmej sīvīšu augleibu.
100 doc#1281 Pēc tam saleidzynōjom 20E un 3D20E aktivitates injekciju eksperimentūs seksuali nūbrīdušom jaunavam, izmontojūt kimiski sintezētu 3D20E (4.a–c att.) un komerciali pīejamū 20E. (4.d att.).Pīvārojams, ka puse nu 3D20E fiziologiskuo leimiņa LRT (1066 pg piec injekcejis pret 2022 pg piec puoruošonuos) izraiseja refraktaru sīvīšu daļu, kas beja 20 reizis augstuoka par 20E fiziologiskū leimini piec p1g3 injekcejis2. vysleluokuo koncentraceja 18 pg piec puoruošonuos; Paplašynuotī dati 1. tabula).Itys rezultats atbylst prīkšstotam, ka 20E seksualuo puornesšona naizraisa puoruošonuos refraktarūs periodus, i tuoļuok nūruoda iz 3D20E kai golvonū faktoru vacuoku i bārnu attīceibu nūdrūšynuošonā.3D20E ari beja īvārojami aktivuoks par 20E olu-la . normals olu deigšonys ātrums, kū mes nūvāruojom piec dalejis EPP klusynuošonys, beja saisteits ar atlykušuos 3D20E aktivitatis asameibu, kū vys vēļ radeja Puoruošonuos izraiseiti sīvīšu faktori.
(a,b) 3D20E kimiski sintezēts nu 20E (a) ar cīši augstu konversiju/efektivitati (dati snāgti kai videjais ± sem nu treju naatkareigu sintezis reakceju) (b).c, Masys spektrs (apakšejuo puse) precizi atbylst ekdizonam, kas atrūnams puoruotā sīvīšu LRT (augšejuo puse ar6, P0¹red).d. 0,02; 0,21 μg, P <0,0001; Fišera precizs tests, divpuseigs) i 10% etanols (0,63 μg, P <0,0001; 0,21 μg, P <0,0001 tikai), bet Fišera exactly beja augstuoks par 0,0001. leluokys devys (0,63 μg, P = 0,0002; 0,21 μg, P = 0,54; Fišera precizais tests, 2-puseigs).e, 3D20E injekceja izraiseja īvārojami augstuokus nārsta ruodeituojus neapstruoduotom muoteitem nakai 10% etanola kontrolis <0,01). 0, 13 μg, P = 0, 0003; Fišera precizais tests, divpuseigs), bet 20E saleidzynojūt ar kontrolem Tikai leluokuos devuos (0, 21 μg, P = 0, 022; 0, 13 μg, P = 0, 0823, divpuseigs tests2d). nārsta līmiņs kai 20E leluokuos devuos (0,21 μg, P = 0,0019; 0,13 μg, P = 0,075; Fišera precizs tests, divpuseigs).Vysūs paneļūs n apzeimoj biologiski naatkareigu ūdu paraugu skaitu,**P, na <0.0.0. ***P < 0,001, ****P < 0,001.Dati ir nu treju atkuortuojumu.
Īprīkšejūs pietejumūs mes nūsacejom, ka steroidu hormonu seksualuo puornesšona izraisa MISO (puoruošonuos izraiseitais oogenezis stimulators 11) ekspreseju, sīvīšu reproduktivuo gena, kas aizsargoj A. gambiae sīvītis nu P. falciparum īvesšonys infekcejis Veseleibys izmoksys, kū izraisa 13, malarejis nuovejūšuokuo cylvāka paraGSO. Anopheles vierteibu malarejis endemiskajūs apgobolūs, mes nūlēmem nūsaceit, kurs hormons 3D20E voi 20E izraisa ituo gena ekspresiju.Mes atkluojom, ka, cikom 20E injekceja eipaši voi spieceiguok izraisa dažus kūdulhormonu receptorus (HR), par pīmāru, HR3 i HR4, i tipiskī dzeļteņu mierķi lejā. Vg14, 15, 16, MISO beja stypruok izraiseits ar 3D20E (Paplašynuotī dati 3. att.).Taitod, ituo androgenuo steroidu hormona seksualuo puornesšona, ruodīs, izraisa mehanismus, kas aizsargoj sīvītis nu izmoksu, kū roda dažaidys parazitiskuos infekcejis. E receptors EcR, izraisūt EcR-A i represejūt EcR-B, i stypruok izraisūt cytus puoruošonuos izraisūtūs genus, tymā skaitā HPX15, kas ītekmej sīvīšu augleibu. par lobu aktivizej diveji ekdizona hormoni, kas var byut dzymumam rakstureiguos funkcejis pamatā.
Tuoļuok mes puorbaudejom myusu bioinformatikys cauruļvadā identificātūs diveju EcK genu funkceju.EcK1 voi EcK2 klusynuošona radeja īvārojamu miersteibu veirīšim (Paplašynuotī dati 4.a att.), kas līcynoj, ka ekdizona fosforoliešona, i taidā veidā inaktivaceja, ir svareiga izdzeivuošonai. 100 doc#1281 MAGs ar proteomiku (2. att. b, c un 2. papyldu tabula), mes apstyprynōjom tō ekdisteroidu kinazis aktivitati, inkubejūt tū ar 20E, kura rezultatā tyka fosforolizeita 20E22P (paplašynōtī dati 2. att.).4b). 3D20E22P (Paplašynuotī dati 4.c att.), kas līcynoj, ka 20E, na 3D20E var byut vālamais EcK2 mierkis.
Saskaņā ar myusu RNS-seq analizi EcK2 beja cīši izteikts ari jaunūs sīvīšu LRT, kur tys tyka izslāgts piec puoruošonuos (2. att. b).Mes apstyprynuojom itūs datus i nūsacejom, ka EcK2 ekspresiju naītekmej ašņa barošona (Paplašynuotī dati 5. att. a).MS paplašynojūt myusu peitiak in, 2. att. b). 20E22P beja cīši saisteits ar 20E maksimumu (22-26 stuņdis piec ašņa iedīņreizis; Paplašynuotī dati 5.b att.).EcK2 klusynuošona jaunom sīvītem radeja 3 reizis leluoku 20E pret 20E22P relativū attīceibu pīaugumu, apstyprynoj c i 26 h E att. EcK2 ari fosforilej 20E sīvītēs.Pīzeimoj, ka EcK2 nūplyudušys jaunovys uzturēja pylnu seksualū uztvereibu (Paplašynuotī dati 5d,e att.), kas vēļ vaira līcynoj, ka sīvīšu ražuošona 20E naizraisa puoruošonuos refraktarus periodus, saleidzynojūt vairuok kontrolis ar e- 100 doc#1281 Ka 30% jaunovu, kas īdūd olas (Paplašynuotī dati 5f att.).Ja piec ašņa barošonys tyka veiktys dubultvērtinis Eck2 RNS (dsEcK2) injekcejis, nārsta nanūtyka, tymā šaļtī 20E maksimums ašņa uzjimšonys deļ beja sasamazynuojs piec ašņa uzjimšonys rezultatim. nārstu, bet tikai tod, kod nārsta bloks (EcK2 un, īspējams, cyti faktori) teik izslāgts ar pōrōšonu.Ni 20E, ni 3D20E injekcijas naīmīrynōja EcK2 ekspresiju jaunavom (Paplašynōtī dati 5g att.), kas līcynoj, ka cyti faktori veicynoj šōs moksas kinazis inhibiciju. pīteikami, lai izraiseitu puoruošonuos diskomfortu, bet tyka efektivi izraiseiti ar augstim seksuali puornastuo 3D20E titri.
Myusu rezultati snādz svareigu īskotu mehanismūs, kas regulej A. gambiae reproduktivūs panuokumus. aktivizēt 3D20E sīvītem, reagejūt iz veirīšim rakstureiguos EPP seksualū puornesšonu.Pi myusu zynuošonom, tys ir pyrmais pīmārs veirīšu i sīvīšu dominātai steroidu hormonu sistemai, kas veic unikalu i kritisku funkceju kukaiņūs.Veirīšim rakstureiga ekdizona funkceja ir definitivi demonstrāta, bet na largei postulāta. hipoteze ir, ka ituos funkcejis var veikt 20E prekursors E1.Ir labi zynoms, ka drozofilā monandreju izraisa mozūs dzymuma peptidu seksualuo puornesšona19,20, kas sovstarpeigai īsadorboj ar neironi, kas inervej sīvīšu reproduktivū traktu nūteicūšūs sīvīšu reproduktivū ceļu, caur specifiskim dzymuma peptidu receptorim2 ir lejupstreipis signals2F. kaskadis, kurys kontrolej 3D20E A. gambiae muoteitem i nūsaceit, voi ituos kaskadis var saglobuot storp ūdim i Drosophila.
Ņemūt vārā 3D20E svareigū lūmu iz sīvīšu augleibu i uzvedeibu, kas konstatāta myusu pietejumā, celi, kas vad pi 3D20E sintezis i aktivacejis, pīduovoj jaunys īspiejis nuokūtnis uodu apkaruošonys strategejom, par pīmāru, konkurētspiejeigu sterilu tieveņu paaudze imite wild insect the U3. virgin play.3D20E veirīšim rakstureiguo funkceja var byut atsateistejuse, kod A. gambiae i cytys Cellia sugys īgiva spieju sareagulēt sovu spermu puoruošonuos aizbārumūs, partū ka tys ļaun efektivi puornest lelu skaitu hormonu i monary hormonu i hormonu aktivizejūšūs enzimu.Sovukuort 3D2. (caur augstu MISO izteiksmi), lai atbaļsteitu jūs reproduktivū vierteibu apgobolūs, kur ir augsta malarejis izplateiba, kas natīši veicynoj Plasmodium puornesšonu.Jamūt vārā, ka ir pīruodeits, ka sīvītem 20E ir dziļa ītekme iz P. falciparum izdzeivuošonu i augšonu hormonūs ir Anopheles bomosquitoidu ceļa sīvītis. niu golvonī uodu i parazitu sovstarpeiguos darbeibys aspekti.
A. gambiae G3 calmi tyka audzāti standarta kukaiņu apstuokļūs (26-28 °C, 65-80% relativais mytrums, 12:12 h gaišs/tymss fotoperiods).Kūrpis baroj ar zivu bareibu pulverveida (TetraMin tropiskuos pūdys, Koi Stickul a:7 TetraMin attīceiba). uodi tyka baroti ad libitum ar 10% dekstrozis šķīdumu i kasnedelis cylvāka ašni (pietejuma ašņa sastuovdalis).Neapstruoduoti uodi tyka īgiuti, atdolūt dzymumus zīdu stadejā piec golu puorbaudis ar mikroskopeju.Tieveņi, kas nas DsRed transgenu, ir apraksteiti īprīkš.
Pīspīdu puoruošonuos eksperimenti tyka veikti saskaņā ar īprīkš apraksteitajim protokolim.Dabiskai puoruošonuos 4 dīnys vacys jaunavys muotis divejis naktis tyka turātys 1:3 attīceibā ar seksuali nūbrīdušim jaunajom tievenim.Eksperimentim, kurūs tieveņus injicēja ar dsEPP, co-caging phojeta sakryta ar da-4. maksimali apklusynuots (Paplašynuotī dati 2.b att.).
Uodu audi, atlykušī myrūni (puorejuo kermeņa daļa), voi vyss kermins tyka izdaleiti 100% metanolā i homogenizāti ar krellis (2 mm stykla krellis, 2400 apgr./min., 90 sek).Audu daudzumi i metanola tylpumi beja itai: puorejuo kermeņa daļa,50 μ0. MAG, 50–100 80 μl; female LRT, 25–50 80 μl.Nūgulumi tyka pakļauti ūtrai metanola ekstrakcejai ar taidu pošu metanola tylpumu.Šyunu atkrytumi tyka izjimti ar centrifugaceju.Metanols nu obeju ekstrakceju apvīnuoja i žāluoja zam sluopekļa plyusmys, tod atkuortuoti suspendej itaidā tylpumā methanā80. 50 μl; MAG un sīvīšu LRT, 30 μl.
Paraugi tyka analizāti masys spektrometrā (ID-X, Termo Fišers), kas savīnuots ar LC instrumentu (Vankišs, Termo Fišers). (iudiņs, 0,1% mudskuobe) un B (acetonitrils, 0,1% mudskuobe).LC gradients beja taids: 5% B 1 minuti, tod palelynuoja leidz 100% B 11 minotu laikā.Piec 8 minotom pi 100%, atkuortuoti plyudynoj kolonu pi00. ml min-1.Jonizaceju MS olūtā veic ar karseitu elektrosmiļkšu jonizaceju pozitivūs i nagativūs režimūs.
Masys spektrometrs mierej datus m/z diapazonā nu 350 leidz 680 60 000 izškiertspiejā pylnā MS režimā.MS/MS dati tyka īgiuti par [M + H]+ (vysi mierķi), [M - H2O + H]+ (vysi mierķi), i [M - H]- (mierķa ecMS/H]- (fosforilātūs mierķu eipašeibys). 100 doc#1281 Lai identificātu namierķtieceigūs ekdisteroidus, tyka analizāti MS/MS dati par vysom HPLC viersyunem ar >15% relativū daudzumu.Kvantitativi nūsaceit, izmontojūt standarta līknis, kas izveiduotys nu teiru standartu (20E, 3D20E), lai apriekinuotu absolutūs daudzumus voi atšķaidejumus vīnam cytam mierķa paraugam, lai apriekinuotu tūs daudzumus, lai apriekinuotu vīna cyta mierķa daudzumu ( veirīši.3D20E kvantitativuo nūsaceišona tyka veikta, izmontojūt itaidus aduktu summu: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-.Dati tyka izjimti i kvantitativi nūsaceiti, izmontojūt Tracefinder (4.1. verseja). E, 20E i 3D20E spektri tyka saleidzynuoti ar attīceigajim standartim.3D20E22P tyka analizāts ar atvasynuojumu ar Žirarda reagentu.20E22P tyka analizāts ar m/z attīceibu.
3D20E22P tyka atteireits nu MAG.Atteireišona tyka veikta analitiskā mārūgā, izmontojūt ultraveiktspējys škidruo hromatografa (Acquity, Waters) ar kvadrupola masys bazis detektoru (QDa, Acquity, Waters) taidā pošā LC apstuokļūs, kai tyka veikta HPLC-MS/MS korrekcejis analize. 3D20E22P tyka konstatāts tymā pošā saglobuošonys laikā, kai īprīkš nūteikts.Piec tam izjimtūs savīnuojumu teireibu puorbaudeja ar HPLC-MS/MS, kai apraksteits īprīkš.
Kūpejuo RNS tyka izjimta nu 10-12 reproduktivūs audu voi cytu kermeņa daļu (bez golvys), izmontojūt Firi reagentu (Thermo Fisher) piec ražuotuoja nūruodejumim.RNS tyka apstruoduota ar TURBO DNazi (Thermo Fisher).cDNS tyka sintezāta, izmontojūt peļu transkripta leikemijis re-V ražuotuoja nūruodejumi.Praimeri reversuos transkripcejis kvantitativajai PCR (RT-qPCR; paplašynuotūs datu 2. tabula) tyka īprīkš publicāti24 voi izstruoduoti, izmontojūt Primer-BLAST26, ar prīkšrūku dūdūt produktim, kuru izmārs ir 70-150 bp i aptver eksonu-eksonu pakronus treis. četri biologiskī atkuortuojumi tyka atšķaidynuoti četrys reizis iudinī RT-qPCR.Kvantitativuo nūsaceišona tyka veikta 15 μl atkuortuotuos reakcejuos, kas satur 1× PowerUp SYBR zaļū meistarmaisejumu (Thermo Fisher), praimerus i 5 μl atšķaidynuotuos cDNS. i dati tyka apkūpuoti i analizāti, izmontojūt Design and Analysis (verseja 2.4.3).Kai paruodeits itymā pietejumā, relativī daudzumi tyka normalizāti ribosomu genam RpL19 (AGAP004422), kura ekspresija byutiski nasamaineja ar ašņa barošonu 27 voi puoruošonuos 3 .
RNS kvalitate tyka puorbaudeita, izmontojūt Agilent Bioanalizator 2100 bioanalizatoru (Agilent).Illumina puorī bibliotekys tyka sagataveitys i vadeitys MIT i Harvardys Plotajā institutā.Sekvenciešonys nūlasejumi tyka saskaņuoti ar A. gambiae genomu (PEST calms, 4.12. parametri.Lasejumi ar kartiešonys kvalitati (MAPQ) punktim <30 tyka izjimti, izmontojūt Samtools (verseja 1.3.1).Lasejumu skaits, kas kartēti iz genim, tyka saskaiteits, izmontojūt htseq-count (verseja 0.9.1) ar nūklusātū parametrim.Normalizāti lasejumu skaits tyka apriekinuots, izteiksmejūt DES vacuma u2. 1.28.1) R (4.0.3 verseja).
Ekdizonu modificejūšūs genu kandidatus identificēja, pyrmū reizi meklejūt A. gambiae genomu, izmontojūt PSI-BLAST algoritmu (https. 100 doc#1281 1,1 un XP_011294434.1) un Mikroplita nūjauktōjs (Pīvīnōšonas Nr. XP_60485 un XP_005182020.1). 100 doc#1281 EcK nu B. mori (pīsavīnuošonys nr. NP_001036900), drozofilys melanogasterys (pīsavīnuošonys nr. NP_651202), Apis mellifera (pīsavīnuošonys nr. XP_394838) i pisuma (pīsavīnuošonys nr. XP_394838). XP_001947166); i EPP nu B. mori (Pīsavīnuošonys Nr. XP_001947166) NP_001177919,1 i NP_001243996.1) i EO D. melanogaster (Pīsavīnuošonys Nr. fragmenti/kilobazis eksoni iz miļjonu kartētūs nūlasejumu (FPKM) voi >85%) reproduktivajūs auduos (sīvīšu LRT voi MAG) Gambejā (2. sūļs ). Kab uzlobuotu specifiskumu, mes izavieliejom kandidatu enzimus, kas izapauž ari A. albimanus, anofelu sugys, kas puoruošonuos laikā nasintezej i napuornas ekdizonu, reproduktivajūs auduos.Kandidatu geni tyka filtrāti, bolstūtīs iz zamu ekspresiju (<100 FPKM voi <85. gola filtrs (4. sūļs), kandidatu genim ir juoapmīrynoj vysmoz vīns nu itūs: (1) īvārojami augšuok regulāts piec puoruošonuos (P < 0, 05) saskaņā ar diferenciāti ekspresātūs genu analizi i (2) nareproduktivūs audus (< 85 % voi <100 FPKM).
100 doc#1281 Mes puorveiduojom īprīkš apraksteituos metodis 28,29,30, lai sasnāgtu vysa organisma izotopu markiešonu.Īsuokumā savvalis tipa Saccharomyces cerevisiae II tipa (YSC2, Sigma) tyka puorbaudeita rauga sluopekļa bāzē (BD Difco, DF0335), kas satur (Sigma2vol5/2). 1,7% bez aminoskuobu i amonija sulfata. kulturys bareiba) i 5% 15N amonija sulfats (NLM-713, >99%, Kembridžys izotopu laboratorejis) kai vīneigais sluopekļa olūts.Raugi tyka atgiuti ar centrifugaceju i uodu kūnenis baroj ad libitum leidz pūceņai.Papyldynuojums ar zivim0. catūrtuo insta miersteiba.Piec tam puoruošonuos eksperimentūs ar namarkietim tievenim tyka izmontuotys tikai muoteitis, kab analizātu puoruošonuos laikā puornastū veirīšu proteomu.
4-6 dīnys vacys 15N markietys jaunys muoteitis beja spīstys puoruotīs ar vacumam atbylstūšim namarkietim jaunavam tievenim.Veiksmeiga puoruošonuos tyka puorbaudeita, atkluojūt puoruošonuos spraudņus epifluoresciešonys mikroskopejā.Pi 3, 12, i 24 ZS/min, sīvīšu atriums tyka izdaleiti 45-5. amonija bikarbonata bufers (pH 7,8) un homogenizēts ar pūdu.Homogenatu centrifugēja un supernatantu sajauc ar 50 μl 0,1% RapiGest (186001860, Waters) 50 mM amonija bikarbonata un paraugu uz d nūsyuteits pa nakti iz Vašingtonys Universitatis MacCoss laboratoreju, kur tyka pabeigta parauga sagataveišona LC-MS/MS.Resuspendēt granulu 50 μl 0,1% RapiGest 50 mM amonija bikarbonatā i sonikēt iudiņa vannā.Granulu proteina koncentraceja tyka samazynuota ar B5. mM ditiotreitols (DTT; Sigma), alkilēts ar 15 mM jodacetamidu (Sigma) un inkubēts 37 °C (1:0 50) 1 stuņdi ar tripsinizaciju: tripsina:substrata attīceiba). centrifugaceja 14 000 apgr./min. 10 minūtis 4 °C, lai nūjimtu atkrytumus.Paraugi tyka izmozguoti ar divrežimu cītuos fazis ekstrakceju (Oasis MCX kartridži, Waters) i atkuortuoti suspendeiti 0,1% mudrskuobē, lai gola proteina koncentraceja byutu 0,33 μg MAG lad1U. leidzeigi analizēja nu neapstruoduotim veirīšim.Kotram paraugam tyka analizāti diveji analitiskī atkuortuojumi.Tuoļuok 1 μg nu kotra tyka analizāts, izmontojūt 25 cm kausātu siliceja atkuortuotu 75 μm kolonu ar 4 cm kausātu siliceja Kasil1 (PQ) fritu slazdu Cpick-2. (Fenomenex) i 180 minotu škidruo hromatografeja. Paraugu sagremuošona – MS/MS tyka palaists iz Q-Exactive HF masys spektrometra (Thermo Fisher) ar nanoACQUITY UPLC sistemu (Iudiņs). FASTA datu baze, kas satur ūlboltumvīlu sekveņcis nu Anopheles Gambiae (VectorBase 54. verseja), Anopheles Coluzzi. pīsuorņuotuoji.Peptidu kartei atbylstūšī FDR tyka nūsaceiti, izmontojūt Percolator32 (3.05. verseja) ar slīksni 0,01, i peptidi tyka salykti proteinu identifikacejuos, izmontojūt proteinu taupeibu Limelight33 (2.2.0. verseja). kotrā skriejīnī, kai apraksteits īprīkš.NSAF attīceibā pret kotru proteinu tyka apriekinuots videjais paraugūs nu diveju dažaidu biologiskūs atkuortuojumu.15N markiešona veiksmeigi maskēja sīvīšu proteomu, koč ari nalelu daudzumu namarkietuo proteina varēja konstatēt nu markietom jaunovom.Mes registrējom ra- fema proteina samazynuošonu tikai paraugūs. tehniskūs palaisšonu, kur izejparaugi tyka palaisti piec veirīšu/puoruošonuos paraugu, HPLC “puornesšonys” rezultatā.
Divi antigeni peptidi, QTTDRVAPAPDQQQ (izotipā PA) i MESDGTTPSGDSEQ (izotipā PA i PB) Genscript. ar afinitatis atteireišonu.IgG nu EPP specifiskuokuo truša tyka izmontuots tuoļuokai western blotiešonai.
Rītumu blotim MAG (n = 10, kur n apzeimej biologiski naatkareigu ūdu paraugu skaitu) i sīvīšu LRT (n = 30) nu 4 dīnys vacu jaunu veirīšu i jaunu voi spāka puoruošonuos sīvīšu (<10 piec puoruošonuos), Ūlboltumvīlu ekstrakcejis bufers (50 m8 NP, pH 0,25% nātrija dezoksiholats;150 mM NaCl;1 mM EDTA;1× proteazis inhibitora kokteiļs (Roche)) tyka pīvīnuots atseviški. centrifugaceja 20 000 g 4 °C.Ūlboltumvīlys tyka kvantitativi nūsaceitys ar Bredfordys testu (Bio-Rad).Piec tam 20 μg MAG ūlbaltumvīlys, 40 μg LRT ūlboltumvīlys i 20 μg atlykušuo bīzpīna ūlbaltumvīlys tyka puorveiduoti i atdaleiti ar 10% NuPSPA buferinu. polivinilidena fluorida membranys, izmontojūt iBlot2 puornesšonys sistemu (Thermo Fisher).Membranys tyka div reizis izmozguotys 1× PBS-T (0,1% Tween-20 PBS) i piec tam blokātys Odyssey blokiešonys buferā (Li-Cor) 1 stuņdi 22°C. poliklonaluo primaruo antivīla (1:700 blokejūšajā buferī) i žurku antiaktina monoklonaluo primaruo antivīla MAC237 (Abeam; 1:4000).Membranys tyka izmozguotys ar PBS-T i piec tam inkubātys ar sekundarajom antivīlom (ezeļa prettrušu 800CW (LT0CW) voi kozu anti-80CW). 1:20,000) blokiešonys buferī, kas satur 0,01% SDS i 0,2% Tween -20 1 stuņdi 22 °C.Membranys tyka izmozguotys ar PBS-T i attāluotys ar Odyssey CLx skeneri.Attāli tyka apkūpuoti i apstruoduoti Image Studio atbylstūšā i2A joslai (verseja the5). kDa) natyka atkluots.
EPP kodiešonys regioni (kai izoforma AGAP002463-RB, kas satur histidina fosfatazis domenu, NCBI konservātuo domena mekliešona 34) i EcK2 (AGAP002181) tyka klonāti pET-21a(+) plazmidā (Novagena milporu sigma) ; praimeri ir uzskaiteitys paplašynuotūs datu 2. tabulā.Ostoni GS4 savīnuotuoji (tandemā) tyka īlykti pyrma pET-21a(+)-EcK2 konstrukcejis C-terminala 6xHis birkys.Rekombinantī proteini tyka ražuoti, izmontojūt NEBExpress bezšyunu E. coli proteina sintezis reakceju (N). NEBExpress Ni spin kolonys (Jaunanglejis BioLabs). Dihidrofolatu reduktazis (DHFR) kontrolis proteins tyka ražuots, izmontojūt DNS veidni nu NEBExpress bezšyunu E. coli proteinu sintezis komplekta. Ūlboltumvīlys tyka uzglobuotys 50% glicerolā PBS -20 °C leidz pat mienešim.
EPP i audu ekstraktu fosfatazis aktivitati miereja, izmontojūt 4-nitrofenilfosfatu (pNPP; Sigma-Aldrichs).Reakcejis buferā beja 25 mM Tris, 50 mM etiķskuobe, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, mED1. homogenizāts reakcejis buferā i šyunu atkrytumi tyka nūjimti ar centrifugaceju.Suokt reakceju, pīvīnojūt enzimu voi audu ekstraktu reakcejis buferam, kas satur 2,5 mg ml-1 pNPP.Reakcejis maisejumu inkubēja ustobys temperaturā tymsā, i ​​kvantitativi nūsaceits nu pNP konver 405 nm vysaidūs laikūs.
In vitro EcK aktivitatei proteinu inkubēja ar 0,2 mg 20E voi 3D20E 200 μl buferā (pH 7,5), kas satur 10 mM HEPES-NaOH, 0,1% BSA, 2 mM ATP i 10 mM MgCl2 atgrīzšonu 2 h. 800 μl metanola, tod atdzesēts -20 °C 1 stuņdi, tod centrifugēts 20 000 g 10 minūtis 4 °C.Piec tam supernatantu analizēja ar HPLC-MS/MS.Lai kontrolis grupā izmontuotūs proteinus termiski inaktivēja glicerā P02. min 95°C.
In vitro EPP aktivitatei proteinu inkubēja ar 3D20E22P (atbylstūši daudzumam, kas atrūnams 18 MAG puorūs, atteireiti ar HPLC-MS/MS) 100 μl buferā (pH 7,5), kas satur 25 mM Tris, 50 mM Bi2M etiķskuobi m50. NaCl, 0,1 mM EDTA, un 1 mM DTT 3 stuņdes 27 °C.Reakceja tyka apturāta, pīvīnojūt 400 μl metanola un atdzesejūt -20 °C 1 stuņdi, pēc tam centrifugēja ar 20 000 g ar superHPMS/d 4 °C.
100 doc#1281 PCR fragmenti EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp) un EcK2 (556 bp) tyka pastiprynōti nu cDNS, kas sagatavōta nu jaukta dzymuma bezgolvu ūdu myrūnim. pCR2,1-eGFP; PCR praimeri ir uzskaiteiti paplašynuotūs datu 2. tabulā. PCR fragments tyka īlykts storp apgrīztim T7 promotorim iz pL4440 plazmidys. Plazmidys konstrukcejis tyka atgiutys nu NEB 5-α kompetentuos E. coli (Jaunanglejis datu biolaboratorejuos) i pyrma lītuošonys puorbaudeitys ar DNS sekvenciešonu. 100 doc#1281 PL4440 plazmidys plazmidys pastyprynuotu īliktni. PCR produkta izmāru apstyprynuoja ar agarozis gela elektroforezi. apraksteits.
dsRNS injekcejai 1380 ng dsRNS (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) tyka injicāti 10 ng nl-1 koncentracejā pīaugušu veirīšu voi sīvīšu kryutī (Nanojekts III, Drummond) 1 dīnys laikā piec eklozejis leiminī. RNS ekstrakceja, cDNS sinteze i RT-qPCR.Ekdizona injekcejai 4 dīnys vacom jaunom voi 6 dīnys vacom jaunom ar ašni barojamom sīvītem injicēja 0,13, 0,21 voi 0,63 μg 20E voi 3D20E koncentracejuos. attīceigi, atkareibā nu eksperimentaluos konstrukcejis voi 6,3 ng nl-1.Iudinī īlīk 100 nl 10% (tilp./tilp.) etanola; 100 nl 3D20E22P 10% etanolā (atbylst 75% nu daudzuma, kas atrūnams puori MAG).Uodi tyka najauši īdaleiti injekceju grupā.
Nārsta testim 3 dīnys vacys muoteitis baroj ad libitum ar cylvāka ašni.Izjimt daleji barojamūs voi nabarotūs ūdus.Atkareibā nu apstruodis muoteitis četrys naktis lyka atsevišķuos nārsta krūzeitēs vysmoz 48 stuņdis piec ašņa iedīņreizis,S Olys tyka skaiteitys 80); puoruotom muoteitem olas, kas izškeļ kūneņuos, tyka skaiteitys par augleigom.
Puoruošonuos izmieginuojumim muoteitem atkareibā nu uorstiešonys ļuove vysmoz 2 dīnys atteisteit rezistenci pret puoruošonu, i sovvalis tipa vacumam atbylstūšus tieveņus piečuok īvīse tymā pošā būrī. mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, un 25 mM NaCl (pH 8,2).Paraugus inkubēja ar Proteinazi K (0,86 μg μl-1) 15 minūtis 55 °C, pēc tam 10 minūtis tyka sagatavōtas qPCR difold DNS. Y hromosomys sekveņču nūsaceišona; praimeri ir uzskaiteitys paplašynuotūs datu 2. tabulā.Y hromosomys sekveņcis tryukums nūruoda iz puoruošonuos.
Atkuortuotys puoruošonuos testim ar spāku puoruošonuos muoteitis tyka puorbaudeitys par puoruošonuos aizbārumu kluotbyutni, kab apstyprynuotu puoruošonuos statusu i ļuove 2 dīnys izaveiduot iztureiba pret puoruošonuos, ka nav tieveņu, kai apraksteits īprīkš 36 .Tieveņi, kas nas DsRed transgenū spermu, piec tam īvīse muoteitēs. pūsmi tyka atdaleiti nu muoteitem, i genoma DNS tyka sagataveita, kai apraksteits īprīkš, i pakļauta DsRed transgena qPCR nūsaceišonai; praimeri ir uzskaiteitys paplašynuotūs datu 2. tabulā.DsRed transgena tryukums nūruodeja, ka nav nūtykuse atkuortuota puoruošonuos.
3D20E tyka atkuortuoti sintezāts, kai īprīkš apraksteits 37 .Īsuokumā 10 mg 20E (Sigma-Aldrich) izšķīdynuoja 10 ml iudiņa, piec tam pīvīnuoja 30 mg platina malnuo (pulvera veidā, Sigma-Aldrich).Tyka maiga burbuļveida straume O2. maisej ustobys temperaturā.Piec 6 stuņžu pīvīnoj 30 mL metanola, lai apturātu reakceju.Maisuojumu centrifugēja, lai nūjimtu katalizatora dalenis.Supernatantu iztvaikuoja leidz sausumam vakuomā ustobys temperaturā.Žāluotū reakcejis produktu izšķīdynuoja %HPhanol/MShanol-0. analize.Pōrvērsšonas līmiņs (nu 20E leidz 3D20E) beja apmāram 97% (4. att. b), un sintezētō 3D20E MS spektrs atbylda tam, kas atrūnams pōrvītōtom muoteitem (4. att. c).
Legendā ir konkretys detalis par veiktajim statistikys testiem.GraphPad (9.0 verseja) tyka izmontuots, kab veiktu Fišera precizū testu, Mantela-Koksa testu i Studenta t-testu.Kohrana-Mantela-Henszela testi tyka veikti, izmontojūt pīlāguotu R skriptu (pīejams 100 . Datu sadalejums tyka puorbaudeits par normalitati, izmontojūt Šapiro-Vilka testu ar nūzeimeiguma slīksni 0,05.Kod dati naizadeve normalitatis testā, tyka veikts Manna-Vitnija tests.Izdzeivuošonys dati tyka analizāti, izmontojūt patelCoverx. 1.28.1) tyka izmontuots, kab veiktu RNS-seq genu leimiņa diferencialuos ekspresejis analizi.Horizontaluo jūsla iz grafika attāloj videjū.Kai slīksni vysim testim tyka izmontuota nūzeimeiguma vierteiba P = 0,05.
Vaira informacejis par pietejuma dizainu var atrast Dobys pietnīceibys ziņuojuma konspektā, kas saisteits ar itū rokstu.
MS proteomiskī dati tyka īlykti ProteomeExchange konsorcijā (proteomecentrals.
RNS-seq datu kūpa ir īlykta Genu ekspresejis vysaptverūšajā bibliotekā zam serejis īroksta GSE198665.
Papyldu datu kūpys, kas izveiduotys i/voi analizātys ituo pietejuma laikā, var dabuot nu attīceigūs autoru piec pamatuota pīprasejuma.Itymā rokstā snāgti olūta dati.
De Lufs, A. Ekdisteroidi: nūlaideiti kukaiņu dzymuma steroidi?Veirīši: Malnuo kaste.Kukaiņu zynuotne.13, 325–338 (2006).
Redferns, CPF 20-hidroksiekdizons i olnīku atteisteiba Anofelā Stefenā.J. Kukaiņu fiziologeja.28, 97.–109.