Imunomodulejūšī metaboliti ir golvonuo audzieja mikrovidis (TME) īzeime, tok ar dažim izjāmumim tūs identitate vys vēļ lelā mārā nav zynoma. Ite mes analizējom audziejus i T šyunys nu pacientu ar augstvierteigu serozū karcinomu (HGSC) audziejim i ascite, kab atkluotu itūs dažaidūs TME nūdaļu metabolomu. Ascitam i audzieja šyunom ir lelys metabolitu atškireibys. Saleidzynojūt ar ascitu, audzieju infiltrejūšuos T šyunys ir īvārojami bogotynuotys ar 1-metilnikotinamidu (MNS). Koč i MNS leimiņs T šyunuos ir paaugstynuots, nikotinamida N-metiltransferazis (enzima, kas katalizej metilgrupu puornesšonu nu S-adenozilmetionina iz nikotinamidu) ekspreseja ir īrūbežuota leidz fibroblastim i audzieja šyunom. Funkcionali MNS izraisa T šyunys izdaleit audzieju veicynojūšū citokinu audzieja nekrozis faktoru alfa. Deļtam nu TME atvasynuotais MNS veicynoj T šyunu imunreguliešonu i ir potencials imunterapejis mierkis cylvāka vieža uorstiešonai.
Nu audzieju atvasynuotim metabolitim var byut dziļa nūmīrynūša ītekme iz pret audzieju imunitati, i vys vaira pīruodejumu līcynoj, ka tī var kolpuot ari par golvonū dziniejspāku slimeibu progresejai (1). Papyldu Varburga efektam jaunuokais dorbs ir suokts, kab raksturuotu audzieja šyunu vīlmainis stuovūkli i tuo saisteibu ar audzieja mikrovidis (TME) imunstuovūkli. Pietejumi par peļu modelim i cylvāka T šyunom ir paruodejuši, ka glutamina metabolisms (2), oksidativais metabolisms (3) i glikozis metabolisms (4) var dorbuotīs naatkareigi iz dažaidom imunšyunu apakšgrupom. Vairuoki metaboliti itymūs ceļūs nūmīrynoj T šyunu pretaudzieja funkceju. Ir pīruodeits, ka koenzima tetrahidrobiopterina (BH4) blokada var būjuot T šyunu proliferaceju, i BH4 pīaugums organismā var uzlobuot CD4 i CD8 mediātū pret audzieju imunreakceju. Bez tuo, kinurenina imunosupresejis īdarbeibu var izgluobt, lītojūt BH4 (5). Izocitratu dehidrogenazis (IDH) mutantajā glioblastomā enantiometaboliskuo (R)-2-hidroksiglutarata (R-2-HG) sekreceja nūmīrynoj T šyunu aktivaceju, proliferaceju i citolizis aktivitati (6). Naseņ ir pīruodeits, ka metilglioksalu, glikozis blokusproduktu, ražoj mieloidu izceļsmis supresoru šyunys, i metilglioksala T šyunu puornesšona var nūmīrēt efektoru T šyunu funkceju. Ārstēšonā metilglioksala neitralizaceja var puorvarēt mieloidu atvasynuotu supresoru šyunu (MDSC) aktivitati i sinergiski uzlobuot kontrolpunktu blokadis terapeju peļu modeļūs (7). Itī pietejumi kūpā pastreipoj TME atvasynuotūs metabolitu golvonū lūmu T šyunu funkceju i aktivitatis reguliešonā.
T šyunu disfunkceja ir plaši ziņuota olnīku viezī (8). Tys ir daleji saisteits ar hipoksejai rakstureigajom vīlmainis eipašeibom i naparostai audzieja vaskulaturai (9), kuo rezultatā glikoze i triptofans puorsavierš par blokusproduktim, par pīmāru, pīnskuobi i kinureninu. Pōrmēreigs uorpusšyunu laktats samazynoj interferona-γ (IFN-γ) ražōšonu un veicynoj mielosupreseju apakšgrupu diferenciaciju (10, 11). Triptofana lītuošona tīši nūmīrynoj T šyunu proliferaceju i nūmīrynoj T šyunu receptoru signaliziešonu (12-14). Nasaverūt iz itim nūvāruojumim, daudz dorbu par imunmetabolismu tyka veikts in vitro T šyunu kulturā, izmontojūt optimizātu bareibu, voi īrūbežojūtīs ar homologim peļu modelim in vivo, nu kurūs nivīns piļneibā naatspīgeļoj cylvāka vieža navīndabeigumu i fiziologiskū makro i mikro vidi.
Olnīku vieža izplateita īzeime ir peritonealuo izplateiba i ascita pasaruodeišona. Šyunu škidruma uzakruošona ascitā ir saisteita ar progresejūšu slimeibu i švaku prognozi (15). Saskaņā ar ziņuojumim, itei unikala nūdaļa ir hipoksiska, tam ir augsts vaskularuo endotelia augšonys faktora (VEGF) i indoleamina 2,3-dioksigenazis (IDO) leimiņs, i tū infiltrej T regulejūšuos šyunys i mieloidu inhibejūšuos šyunys (15-18). Ascita vīlmainis vide var byut atškireiga nu poša audzieja, partū T šyunu puorprogramiešona peritonealajā telpā ir naskaidra. Pi tam golvonuos atškireibys i navīndabeigums storp ascitu i metabolitim, kas atsarūn audzieja vidē, var traucēt imunšyunu infiltraceju i tūs funkceju iz audziejim, ir vajadzeigi tuoļuoki pietejumi.
Kab atrysynuotu ituos problemys, mes izstruoduojom jiuteigu šyunu atdaleišonys i škidruos hromatografejis tandema masys spektrometrejis (LC-MS/MS) metodi, kab pieteitu dažaidus šyunu veidus (tymā skaitā CD4 + i CD8 + T šyunys), kai ari audzieju īškpusē i storp tim Tuos metaboliti aptver šyunys vīnā ascitā i audzieja pacienta vidē. Mes izmontojam itū metodi kūpā ar augstdimenseju plyusmys citometreju i vīnys šyunys RNS sekvenciešonu (scRNA-seq), kab snāgtu cīši izškiertu itūs golvonūs populaceju vīlmainis statusa portretu. Itei metode atkluoja īvārojamu 1-metilnikotinamida (MNS) leimiņa pīaugumu audzieja T šyunuos, i in vitro eksperimenti paruodeja, ka MNS imunomodulacejis ītekme iz T šyunu funkcejom īprīkš nabeja zynoma. Kūpumā itei metode atkluoj sovstarpejū vīlmainis sovstarpeigū darbeibu storp audziejim i imunšyunom i snādz unikalu īskotu imunreguliešonys metabolitūs, kas var byut nūdereigi iz T šyunu baļsteitys olnīku vieža imunterapejis uorstiešonai.
100 doc#1281 Izmontuojom augstdimenseju plyusmys citometreju, lai vīnlaiceigi nūsaceitu glikozis uzjimšonu [2-(N-(7-nitrofenil-2-oksa-1,3-diaza-4-il)amino)-2-dezoksiglikozis (2-NBDG) i mitohondreju aktivitati [MitoTracker dziļi sorkons, DR,1 tipiskī markeri, kas atškir imunšyunys i audzieja šyunu populacejis (S2 tabula i S1A attāls). Itei analize paruodeja, ka saleidzynojūt ar T šyunom, ascitam i audzieja šyunom ir augstuoks glikozis uzjimšonys leimiņs, bet ir mozuokys atškireibys mitohondreju aktivitatē. Videjuo glikozis uzjimšona audzieja šyunuos [CD45-EpCAM (EpCAM)+] ir treis leidz četrys reizis leluoka par T šyunu, i videjuo glikozis uzjimšona CD4 + T šyunuos ir 1,2 reizis leluoka par CD8 + T šyunu, kas nūruoda, ka audzieja infiltrejūšajim limfocitim (TIL) ir atškireigi TME metaboliskajim). Sovukuort mitohondreju aktivitate audzieja šyunuos ir leidzeiga CD4 + T šyunu aktivitatei, i obeju veidu šyunu mitohondreju aktivitate ir augstuoka par CD8 + T šyunu aktivitati (1. att. B). Kūpumā itī rezultati atkluoj vīlmainis leimini. Audzieja šyunu vīlmainis aktivitate ir augstuoka par CD4 + T šyunu, i CD4 + T šyunu vīlmainis aktivitate ir augstuoka par CD8 + T šyunu. Nasaverūt iz itū ītekmi vysaidūs šyunu veidūs, nav konsekventu atškireibu CD4 + i CD8 + T šyunu vīlmainis statusā voi tūs relativajuos proporcejuos ascitā, saleidzynojūt ar audziejim (1. att. C). Sovukuort CD45 šyunu frakcejā EpCAM+ šyunu daļa audziejā pīauga, saleidzynojūt ar ascitu (1. att. D). Mes ari nūvāruojom skaidru vīlmainis atškireibu storp EpCAM+ i EpCAM- šyunu sastuovdaļom. EpCAM+ (audzieja) šyunom ir leluoka glikozis uzjimšona i mitohondreju aktivitate nakai EpCAM- šyunom, kas ir daudz augstuoka par fibroblastu vīlmainis aktivitati audzieja šyunuos TME (1. att., E i F).
(A i B) Glikozis uzjimšonys (2-NBDG) videjuo fluoresciešonys intensitate (MFI) (A) i CD4 + T šyunu mitohondreju aktivitate (MitoTracker tymsi sorkons) (B) Reprezentativi grafiki (pa kreisi) i tabulātī dati (pa labi), CD8 + T šyunu i EpCAM + T šyunu i EpCAM + T šyunu a. (C) CD4 + i CD8 + šyunu (nu CD3 + T šyunu) attīceiba ascitā i audziejā. (D) EpCAM + audzieja šyunu proporceja ascitā i audziejā (CD45−). (E i F) EpCAM + CD45-audzieja i EpCAM-CD45-matricys glikozis uzjimšona (2-NBDG) (E) i mitohondreju aktivitate (MitoTracker tymsi sorkons) (F) reprezentativi grafiki (pa kreisi) i tabulāti dati ( Pa labi) Ascita i audzieja šyunys. (G) CD25, CD137 i PD1 ekspresijis reprezentativi grafiki ar plyusmys citometreju. (H i I) CD25, CD137 i PD1 ekspresija iz CD4 + T šyunom (H) i CD8 + T šyunom (I). (J i K) Naivi, centraluos atminis (Tcm), efektoru (Teff) i efektoru atminis (Tem) fenotipi, kas baļsteiti iz CCR7 i CD45RO ekspresiju. Reprezentativi attāli (pa kreisi) i tabulys dati (pa labi) par CD4 + T šyunom (J) i CD8 + T šyunom (K) ascitā i audziejūs. P vierteibys nūsaceitys ar puorī savīnuotu t-testu (*P<0,05, **P<0,01 i ***P<0,001). Lineja attāloj saskaņuotus pacientus (n = 6). FMO, fluoresceņce minus vīns; MFI, videjuo fluoresciešonys intensitate.
Tuoluokuo analize atkluoja ari cytys byutiskys atškireibys storp cīši izškiertu T šyunu fenotipiskū statusu. Aktivātuo (1. att., nu G leidz I) i efektoru atmiņa (1. att., J i K) audziejūs ir daudz bīžuoka kai ascita (CD3 + T šyunu proporceja). Leidzeigi, analizejūt fenotipu ar aktivacejis markeru (CD25 i CD137) i nūplyusšonys markeru [programātais šyunu nuovis proteins 1 (PD1)] ekspresiju, paruodeja, ka, koč i itūs populaceju vīlmainis eipašeibys ir atškireigys (att. S1, B leidz E) , Bet nikaidys nūzeimeigys vīlmainis atškireibys storp att. F līdz I). Itī rezultati tyka apstyprynuoti, izmontojūt mašynu vuiceišonuos metodis, kab automatiski pīškiertu šyunu fenotipus (21), kas tuoļuok atkluoja lelu skaitu kaulu smedziņu šyunu (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) asameibu pacienta ascitā (S2A attāls ). Nu vysu identificātūs šyunu veidu itai mieloidu šyunu populacejai beja vysleluokuo glikozis uzjimšona i mitohondreju aktivitate (S2 att., nu B leidz G). Itī rezultati izceļ spieceiguos vīlmainis atškireibys storp vairuokim šyunu veidim, kas atrūnami ascitā i audziejūs HGSC sliminīkim.
Golvonais izaicynuojums TIL metabonomiskūs eipašeibu izpratnē ir vajadzeiba izolēt nu audzieju pīteikama teireibys, kvalitatis i daudzuma T šyunu paraugus. Jaunuokī pietejumi ir paruodejuši, ka sakuortuošonys i krellis boguotynuošonys metodis, kuru pamatā ir plyusmys citometreja, var izraiseit izmainis šyunu metabolitu profilūs (22-24). Kab puorvarātu itū problemu, mes optimizējom krellis boguotynuošonys metodi, kab izolātu i izolātu TIL nu kirurgiski izjimta cylvāka olnīku vieža pyrma analizis ar LC-MS/MS (vērtīs Materiali i metodis; 2. att. A). Kab nūvārtātu ituo protokola kūpejū ītekmi iz metabolitu izmaiņom, mes saleidzynuojom veseleigu donoru aktivizātūs T šyunu metabolitu profilus piec augšuok pīmynātuo krellis atdaleišonys sūļa ar šyunom, kas nabeja krellis atdaleitys, bet palyka iz lada. Itei kvalitatis kontrolis analize atkluoja, ka storp itim divejim apstuoklim ir augsta korelaceja (r = 0,77), i 86 metabolitu grupys tehniskajai atkuortuojameibai ir augsta atkuortuojameiba (2. att. B). Deļtam ituos metodis var veikt precizu metabolitu analizi šyunuos, kas teik pakļautys šyunu tipa boguotynuošonai, taidā veidā nūdrūsynojūt pyrmū augstys izškiertspiejis platformu specifisku metabolitu identificēšonai HGSC, taidā veidā ļaunūt cylvākim īgiut dziļuoku izpratni par šyunu specifiku Seksualuo metabolisma programu.
(A) Magnetiskūs krellis boguotynuošonys shematiska diagrama. Pyrma analizis ar LC-MS/MS šyunys tiks pīdzeivuotys treis magnetiskūs krellis boguotynuošonys kuortys piec kuortys voi paliks iz lada. (B) Boguotynuošonys veida ītekme iz metabolitu daudzumu. Treis mierejumu videjais kotram boguotynuošonys veidam ± SE. Pelēkuo lineja attāloj 1:1 attīceibys. Atkuortuotu mierejumu klasis īškejuo korelaceja (ICC), kas paruodeita ass markiejumā. NAD, nikotinamida adenina dinukleotids. (C) Pacientu metabolitu analizis dorba plyusmys shematiska diagrama. Nu sliminīku savuoc ascitu voi audziejus i kriokonservej. Nalela daļa kotra parauga tyka analizāta ar plyusmys citometreju, bet puorejim paraugim tyka veiktys treis CD4+, CD8+ i CD45- šyunu boguotynuošonys kuortys. Ituos šyunu frakcejis tyka analizātys, izmontojūt LC-MS/MS. (D) Standartizātuo metabolitu daudzuma syltuma karte. Dendrograma attāloj Vorda Eiklida attuolumu sakūpuošonu storp paraugim. (E) Golvonūs komponentu analize (PCA) parauga metabolita kartis, paruodūt treis kotra parauga atkuortuojumus, paraugi nu vīna i tuo poša pacienta ir savīnuoti ar lineju. (F) parauga metabolita profila PCA, kas nūsaceits iz pacientu (t.i., izmontojūt daleju atlaišonu); parauga tipu īrūbežoj izlīkts korpuss. PC1, golvonuo sastuovdaļa 1; PC2, golvonuo sastuovdaļa 2.
Tuoļuok mes izmontuojom itū boguotynuošonys metodi, kab analizātu 99 metabolitus CD4 +, CD8 + i CD45 šyunu frakcejuos sešu HGSC sliminīku primarajā ascitā i audziejūs (2. att. C, S3. att. i S3. i S4. tabula). Interesantuo populaceja veidoj 2% leidz 70% nu suokūtnejuo leluo dzeivūs šyunu parauga, šyunu proporceja storp pacientim ir cīši atškireiga. Piec krellis atdaleišonys bogotynuotuo interesis daļa (CD4+, CD8+ voi CD45-) videji veidoj vaira nakai 85% nu vysu dzeivūs šyunu paraugā. Itei boguotynuošonys metode ļaun analizēt šyunu populacejis nu cylvāka audzieja audu metabolisma, kū nav īspiejams izdareit nu lelu paraugu. Izmontojūt itū protokolu, mes nūsacejom, ka l-kinurenins i adenozins, itī diveji labi raksturuotī imunosupresejis metaboliti beja paaugstynuoti audzieja T šyunuos voi audzieja šyunuos (S3, B i C att.). Deļtuo itī rezultati paruoda myusu šyunu atdaleišonys i masys spektrometrejis tehnologejis uzticeibu i spieju atrast biologiski svareigus metabolitus pacientu auduos.
Myusu analize atkluoja ari spieceigu šyunu veidu vīlmainis atdaleišonu pacientu vydā i storp tim (2D att. i S4A att.). Konkreti, saleidzynojūt ar cytim pacientim, 70. pacientam beja atškireigys vīlmainis eipašeibys (2. att. E i S4. att. B), kas nūruoda, ka storp pacientim var byut īvārojama vīlmainis navīndabeiba. Ir vārts pīzeimēt, ka saleidzynojūt ar cytim sliminīkim (1,2 leidz 2 litrim; S1 tabula), kūpejais ascita savuoktais daudzums 70. sliminīkam (80 ml) beja mozuoks. Starppacientu navīndabeiguma kontrole golvonūs komponentu analizis laikā (par pīmāru, izmontojūt daleju redundaņcis analizi) paruoda konsekventys izmainis storp šyunu veidim, i šyunu veidi i/voi mikrovide ir skaidri apkūpuoti atbylstūši metabolitu profilam (2F att.). Atsevišku metabolitu analize pastreipuoja ituos ītekmis i atkluoja byutiskys atškireibys storp šyunu veidim i mikrovidi. Ir vārts pīzeimēt, ka ekstremuokuo nūvāruotuo atškireiba ir MNS, kas parosti ir boguotynuots ar CD45- šyunom i CD4+ i CD8+ šyunom, kas infiltrej audziejā (3. att. A). CD4 + šyunom itei ītekme ir vysradzamuokuo, i ruodīs, ka ari MNS CD8 + šyunuos stypri ītekmej vide. Tok tys nav svareigi, partū ka tikai treis nu sešim pacientim var nūviertēt audzieja CD8+ punktus. Sūpluok MNS dažaidu veidu šyunuos ascitā i audziejūs ir atškireigi boguoti ari cyti metaboliti, kas ir švaki raksturuoti TIL (S3 i S4 attāli). Deļtam itī dati atkluoj daudzsūlūšu imunomodulacejis metabolitu kūpumu tuoluokim pietejumim.
(A) Normalizāts MNS saturs CD4+, CD8+ i CD45- šyunuos nu ascita i audzieja. Kastis laukumā radzams videjais (lineja), storpkvartilu diapazons (kadra eņdžis) i datu diapazons, leidz pat 1,5 reizem storpkvartilu diapazons (kadra ūsys). Kai apraksteits Pacientu materialūs i metodēs, izmontojit pacienta limma vierteibu, kab nūsaceitu P vierteibu (*P<0,05 i **P<0,01). (B) MNS vīlmainis shematiska diagrama (60). Vieļīni: S-adenozil-1-metionins; SAH, S-adenozins-1-homocisteins; NA, nikotīnamids; MNS, 1-metilnikotinamids; 2-PY, 1-metil- 2-piridons-5-karboksamids; 4-PY, 1-metil-4-piridons-5-karboksamids; NR, nikotinamida riboze; NMN, nikotinamida mononukleotids. Enzimi (zaļi): NNMT, nikotinamida N-metiltransferaze; SIRT, sirtuini; NAMPT, nikotinamidu fosforibozilpuornesšonys; AOX1, aldehida oksidaze 1; NRK, nikotinamidu ribozidu kinaze; NMNAT, nikotinamida mononukleotidu adenilatu puornesšonys; Pnp1, purinu nukleozidu fosforilaze. (C) t-SNE scRNS-seq ascita (pelēks) un audzieja (sorkons; n = 3 pacienti). (D) NNMT ekspresija dažaiduos šyunu populacejuos, kas identificātys, izmontojūt scRNS-seq. (E) NNMT i AOX1 ekspresija SK-OV-3, cylvāka embriju nierēs (HEK) 293T, T šyunuos i ar MNS apstruoduotuos T šyunuos. Salyktuo izteiksme ir paruodeita attīceibā pret SK-OV-3. Paruodeits izteiksmis modeļs ar SEM (n = 6 veseli donori). Ct vierteibys, kas ir leluokys par 35, teik skaiteitys par nanūvārojamom (UD). (F) SLC22A1 i SLC22A2 ekspresija SK-OV-3, HEK293T, T šyunuos i T šyunuos, kas apstruoduotys ar 8 mM MNS. Salyktuo izteiksme ir paruodeita attīceibā pret SK-OV-3. Paruodeits izteiksmis modeļs ar SEM (n = 6 veseli donori). Ct vierteibys, kas ir leluokys par 35, teik skaiteitys par nanūvārojamom (UD). (G) Šyunu MNS saturs aktivizātuos veseleiguos donoru T šyunuos piec 72 stuņžu inkubacejis ar MNS. Paruodeits izteiksmis modeļs ar SEM (n = 4 veseli donori).
MNS teik ražuots, puornasūt metilgrupu nu S-adenozil-1-metionina (SAM) iz nikotinamidu (NA) ar nikotinamida N-metiltransferazi (NNMT; 3. att. B). NNMT ir puoruok ekspresāts vysaidūs cylvāku viežūs i ir saisteits ar proliferaceju, invazeju i metastazem (25-27). Kab lobuok saprostu MNS olūtu T šyunuos TME, mes izmontuojom scRNA-seq, kab raksturuotu NNMT ekspresiju vysaidūs šyunu tipūs treju HGSC pacientu ascitā i audziejūs (S5 tabula). Apmāram 6500 šyunu analize paruodeja, ka ascitis i audzieja vidē NNMT ekspresija beja īrūbežuota leidz dūmajamūs fibroblastu i audzieja šyunu populacejom (3. att., C i D). Ir vārts pīzeimēt, ka nav acimradzamys NNMT ekspresijis nivīnā populacejā, kas ekspresej PTPRC (CD45 +) (3D att. i S5A att.), kas nūruoda, ka metabolita spektrā atkluotais MNS ir īvasts T šyunuos. Aldehida oksidazis 1 (AOX1) ekspresija puorvierš MNS par 1-metil-2-piridonu-5-karboksamidu (2-PYR) voi 1-metil-4-piridonu-5-karboksamidu (4- PYR); 3.B attāls) ir īrūbežuots ari fibroblastu populacejai, kas ekspresej COL1A1 (S5A attāls), kas kūpā nūruoda, ka T šyunom tryukst parostuos MNS metabolisma spiejis. Itūs ar MNS saisteitūs genu ekspresejis modeļs tyka puorbaudeits, izmontojūt ūtrū naatkareigu šyunu datu kūpu nu HGSC pacientu ascita (S5B attāls; n = 6) (16). Bez tuo, ar MNS apstruoduotu veseleigu donoru T šyunu kvantitativuos polimerāzis kēdis reakcejis (qPCR) analize paruodeja, ka saleidzynojūt ar kontrolis SK-OV-3 olnīku audzieja šyunom, NNMT voi AOX1 gondreiž nabeja izteikts (3. att. E). Itī nagaideitī rezultati nūruoda, ka MNS var izdaleit nu fibroblastu voi audzieju blokus asūšajuos T šyunuos TME.
Koč i kandidati ir organiskūs kationu puorvadātuoju saime nu 1. leidz 3. (OCT1, OCT2 i OCT3), kū kodej škeidynojūšuo nesēja 22 (SLC22) saime (SLC22A1, SLC22A2 i SLC22A3), MNS potencialī puorvadātuoji vys vēļ ir nanūteikti (28). mRNS QPCR nu veseleigu donoru T šyunu paruodeja zamu SLC22A1 ekspresejis leimini, bet nanūsacejamu SLC22A2 leimini, kas apstyprynuoja, ka par tū īprīkš beja ziņuots literaturā (3. att. F) (29). Sovukuort SK-OV-3 olnīku audzieja šyunu lineja izsaceja augstu obeju transporteru leimini (3. att. F).
Kab puorbaudeitu īspieju, ka T šyunom ir spieja absorbēt svešu MNS, veseleigys donoru T šyunys kultivēja 72 stuņdis dažaidu MNS koncentraceju kluotbyutnē. Eksogenuos MNS tryukuma gadīnī MNS šyunu saturu navar nūsaceit (3. att. G). Tok aktivizātom T šyunom, kas tyka apstruoduotys ar eksogenū MNS, beja nu devys atkareigs MNS satura pīaugums šyunuos leidz pat 6 mM MNS (3. att. G). Itys rezultats nūruoda, ka, nasaverūt iz zamu transportera ekspresejis leimini i golvonuo enzima tryukumu, kas ir atbiļdeigs par intracelularū MNS metabolismu, TIL vys vēļ var uzjimt MNS.
Metabolitu spektrs pacientu T šyunuos i in vitro MNS absorbcejis eksperimentūs palelynoj īspieju, ka ar viezi saisteitī fibroblasti (CAF) izdalej MNS i audzieja šyunys var regulēt TIL fenotipu i funkcejis. Kab nūsaceitu MNS ītekmi iz T šyunom, vasalys donoru T šyunys aktivizēja in vitro MNS kluotbyutnē voi bez tuo, nūviertēja tūs proliferaceju i citokinu ražuošonu. Piec 7 dīnu MNS pīvīnuošonys ar leluokū devu populacejis dubultuošonuos skaits tyka videji samazynuots, bet spāks tyka saglobuots vysuos devuos (4. att. A). Pi tam eksogenūs MNS apstruodis rezultatā pīauga CD4 + i CD8 + T šyunu proporceja, kas ekspresej audzieja nekrozis faktoru-α (TNFα; 4. att. B). Sovukuort IFN-γ intracelularuo ražuošona CD4 + T šyunuos beja īvārojami samazynuota, bet na CD8 + T šyunuos, i interleikinā 2 (IL-2; 4. att., C i D) nabeja byutisku izmaiņu. Deļtuo ar enzimu saisteitais imunosorbentu tests (ELISA) nu itūs ar MNS apstruoduotūs T šyunu kulturu supernatantu paruodeja īvārojamu TNFα pīaugumu, IFN-γ sasamazynuošonu i IL-2 izmaiņu (4. att., E leidz G). . IFN-γ sasamazynuošona nūruoda, ka MNS var byut nūzeime T šyunu pretaudzieja aktivitatis nūmīriešonā. Kab simulātu MNS ītekmi iz T šyunu mediātū citotoksicitati, kimeriskūs antigenu receptoru T (FRα-CAR-T) šyunys, kuru mierkis ir folatu receptori α i CAR-T (GFP), kū regulej zaļais fluoresciejušais proteins (GFP) -CAR-T) šyunys, ražoj veseleigys donoru periferuos šyunys PBMC). CAR-T šyunys kultivēja 24 stuņdis MNS kluotbyutnē, piec tuo kūpā kultivēja ar cylvāka SK-OV-3 olnīku audzieja šyunom, kas ekspresej folatu receptorus α efektora i mierķa attīceibā 10:1. MNS apstruodis rezultatā īvārojams sasamazynuoja FRα-CAR-T šyunu nūgalynuošonys aktivitate, kas beja leidzeigs FRα-CAR-T šyunom, kas apstruoduotys ar adenozinu (4H att.).
(A) Kūpejais dzeivuotspiejeigūs šyunu skaits i populacejis dubultuošonuos (PD) taišni nu kulturys 7. dīnā. Attāloj datus nu vysmoz n = 3 naatkareigu eksperimentu. (B leidz D) CD3/CD28 i IL-2 tyka izmontuoti, kab aktivizātu T šyunys attīceigajuos MNS koncentracejuos 7 dīnys. Pyrma analizis šyunys 4 stuņdis stimulēja ar PMA/jonomicinu ar GolgiStop. TNFα (B) ekspresija T šyunuos. Pīmāra attāls (pa kreisi) i tabulys dati (pa labi) par TNFα ekspreseju dzeivajuos šyunuos. IFN-γ (C) i IL-2 (D) ekspresija T šyunuos. Citokinu ekspreseju miereja ar plyusmys citometreju. Stīņu grafiks attāloj videjū (n = 6 veseli donori) + SEM. Izmontojūt vīnvierzīņa dispersejis analizi i atkuortuotus mierejumus (*P<0,05 i **P<0,01), kab nūsaceitu P vierteibu. Attāloj datus nu vysmoz n = 3 naatkareigu eksperimentu. (E leidz G) CD3/CD28 i IL-2 tyka izmontuoti, kab aktivizātu T šyunys attīceigajuos MNS koncentracejuos 7 dīnys. Bareiba tyka savuokta pyrma i piec 4 stuņžu PMA/jonomicina stimulacejis. TNFα (E), IFN-γ (F) i IL-2 (G) koncentracejis miereja ar ELISA. Stīņu grafiks attāloj videjū (n = 5 veseli donori) + SEM. P vierteiba nūsaceita, izmontojūt vīnvierzīņa dispersejis analizi i atkuortuotus mierejumus (*P<0,05). Punktātuo lineja nūruoda iz atkluošonys atkluošonys rūbežu. (H) Šyunu lizis tests. FRα-CAR-T voi GFP-CAR-T šyunys 24 stuņdis pīlāguoja ar adenozinu (250 μM) voi MNS (10 mM) voi atstuoja naapstruoduotys (Ctrl). Tyka izmiereita SK-OV-3 šyunu procentualuo nūgalynuošona. P vierteiba nūsaceita ar Velča t testu (*P<0,5 i **P<0,01).
Kab dabuotu mehanisku izpratni par nu MNS atkareigū TNFα ekspresejis reguliešonu, tyka nūvārtātys izmainis ar MNS apstruoduotūs T šyunu TNFα mRNS (5. att. A). Veseleigom donoru T šyunom, kas tyka apstruoduotys ar MNS, beja divkuorteigs TNFα transkripcejis leimiņa pīaugums, kas nūruoda, ka MNS ir atkareigs nu TNFα transkripcejis reguliešonys. Kab izpieteitu itū īspiejamū reguliešonys mehanismu, tyka nūvārtāti diveji zynomi transkripcejis faktori, kas regulej TNFα, t.i., aktivizātū T šyunu kūdulfaktoru (NFAT) i specifiskū proteinu 1 (Sp1), atbyldūt iz MNS saisteibu ar proksimalū TNFα promotoru ( 30 ). TNFα promotorā ir 6 identificātys NFAT saisteišonys vītys i 2 Sp1 saisteišonys vītys, kas puorsakluoj vīnā vītā [-55 bāzis puori (bp) nu 5'cap] (30). Hromatina imunoprecipitaceja (ChIP) paruodeja, ka, apstruodojūt ar MNS, Sp1 saisteiba ar TNFα promotoru pasalelynuoja treis reizis. NFAT īkļaušona ari pīauga i tyvuojuos nūzeimei (5. att. B). Itī dati nūruoda, ka MNS regulej TNFα ekspreseju caur Sp1 transkripceju i mozuokā mārā NFAT ekspreseju.
(A) Saleidzynojūt ar T šyunom, kas kultivātys bez MNS, TNFα ekspresejis izmainis T šyunuos, kas apstruoduotys ar MNS. Paruodeits izteiksmis modeļs ar SEM (n = 5 veseli donori). Attāloj datus nu vysmoz n = 3 naatkareigu eksperimentu. (B) T šyunu TNFα promotors, kas apstruoduots ar voi bez 8 mM MNS piec NFAT i Sp1, tyka apvīnuots ar (Ctrl) i PMA / jonomicina stimulaceju 4 stuņdis. Imunoglobulinu G (IgG) i H3 izmontuoja attīceigi kai nagativys i pozitivys kontrolis imunūguļsniešonai. ChIP kvantitativais nūviertiejums paruodeja, ka Sp1 i NFAT saisteiba ar TNFα promotoru ar MNS apstruoduotuos šyunuos pasalelynuoja vairuokys reizis, saleidzynojūt ar kontroli. Attāloj datus nu vysmoz n = 3 naatkareigu eksperimentu. P vierteiba nūsaceita ar vairuokim t-testim (*** P <0, 01). (C) Saleidzynojūt ar HGSC ascitu, T šyunom (nacitotoksiskom) beja palelynuota TNF ekspresija audziejā. Kruosys attāloj dažaidus sliminīkus. Paruodeitys šyunys ir najauši izlaseitys leidz 300 i satrauktys, kab īrūbežuotu puorzeimuošonu (** Padj = 0, 0076). (D) Īrūsynuotais MNS modeļs olnīku vieža gadīnī. MNS teik ražuots audzieja šyunuos i fibroblastūs TME, i tū uzjam T šyunys. MNS palelynoj Sp1 saisteibu ar TNFα promotoru, kas nūvad pi palelynuotys TNFα transkripcejis i TNFα citokinu ražuošonys. MNS izraisa ari IFN-γ sasamazynuošonu. T šyunu funkcejis nūmīriešona nūvad pi samazynuotys nūgalynuošonys spiejis i pauotrynuotys audzieja augšonys.
Saskaņā ar ziņuojumim, TNFα ir nu prīškys i mugorys atkareiga pretaudzieja i pretaudzieja īdarbeiba, bet tam ir labi zynoma lūma olnīku vieža augšonys i metastažu veicynuošonā (31-33). Saskaņā ar ziņuojumim, TNFα koncentraceja ascitā i audzieja auduos sliminīkim ar olnīku viezi ir augstuoka par lobvieleigūs audūs (34-36). Mehanisma ziņā TNFα var regulēt boltūs ašņa šyunu aktivaceju, funkceju i proliferaceju, maineit vieža šyunu fenotipu (37, 38). Atbylstūši itim atkluojumim, diferencialuo genu ekspresejis analize paruodeja, ka TNF tyka īvārojami augšuok regulāts T šyunuos audzieja auduos, saleidzynojūt ar ascitu (5. att. C). TNF ekspresejis pīaugums beja radzams tikai T šyunu populacejuos ar nacitotoksisku fenotipu (S5A attāls). Kūpsavylkumā itī dati atbolsta redzīni, ka MNS ir divejaida imunosupresejis i audzieja veicynuošonys īdarbeiba HGSC.
Fluoresciejušuo markiešona, kurys pamatā ir plyusmys citometreja, ir palykuse par golvonū metodi TIL metabolisma pieteišonai. Itī pietejumi ir paruodejuši, ka saleidzynojūt ar periferūs ašņa limfocitim voi T šyunom nu sekundarūs limfoidu organu, peļu i cylvāka TIL ir leluoka tendeņce uzjimt glikozi (4, 39) i pakuopeniska mitohondreju funkcejis zaudiešona (19, 40). Koč ari mes asam nūvāruojuši leidzeigus rezultatus itymā pietejumā, golvonuo atteisteiba ir saleidzynuot audzieja šyunu i TIL metabolismu nu vīna i tuo poša rezekcejis audzieja audu. Atbylstūši dažim nu itūs īprīškejūs ziņuojumu, audzieja (CD45-EpCAM +) šyunom nu ascitis i audzieju ir leluoka glikozis uzjimšona nakai CD8 + i CD4 + T šyunom, kas atbolsta tū, ka audzieja šyunu augstū glikozis uzjimšonu var saleidzynuot ar T šyunom. T šyunu konkureņcis jiedzīņs. TME. Tok audzieja šyunu mitohondreju aktivitate ir augstuoka par CD8 + T šyunu aktivitati, bet mitohondreju aktivitate ir leidzeiga CD4 + T šyunu aktivitatei. Itī rezultati pastyprynoj jaunū temu, ka oksidativais metabolisms ir svareigs audzieja šyunom (41, 42). Jī ari līcynoj, ka CD8 + T šyunys var byut juteiguokys pret oksidativū disfunkceju nakai CD4 + T šyunys, voi ka CD4 + T šyunys var lītuot cytus ūglekļa olūtus, na glikozi, kab uzturātu mitohondreju aktivitati (43, 44). Juoatzeimoj, ka mes nanūvāruojom atškireibu glikozis uzjimšonā voi mitohondreju aktivitatē storp CD4 + T efektorim, T efektoru atmiņu i T centraluos atminis šyunom ascitā. Leidzeigi ari CD8 + T šyunu diferenciacejis stuovūkļam audziejūs nav nikaida sakara ar izmaiņom glikozis uzjimšonā, izceļūt byutiskū atškireibu storp in vitro kultivātom T šyunom i cylvāka TIL in vivo (22). Itī nūvāruojumi tyka apstyprynuoti ari objektivys automatiskuos šyunu populacejis sadaleišonys izmontuošona, kas vēļ vaira atkluoja, ka CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + šyunys ar leluoku glikozis uzjimšonu i mitohondreju aktivitati nakai audzieja šyunom ir izplateitys, bet tom ir Metaboliskuo aktivuo šyunu populaceja. Itei populaceja var puorstuovēt īspiejamū mieloidu supresoru šyunu voi plazmacitoidu dendritiskūs šyunu apakšpopulaceju, kas konstatāta scRNS-seq analizē. Koč ari par obejim itim ir ziņuots cylvāka olnīku audziejūs [45], jim vys vēļ ir vajadzeigs Tuoļuoks dorbs ir apraksteit itū mieloidu apakšpopulaceju.
Koč i iz plyusmys citometreju baļsteitys metodis var nūskaidruot vyspuorejuos atškireibys glikozis i oksidativajā metabolismā storp šyunu veidim, precizi metaboliti, kū ražoj glikozis voi cyti ūglekļa olūti mitohondreju metabolismam TME, vēļ nav nūsaceiti. Kab pīškiertu metabolitu kluotbyutni voi naasameibu nūteiktai TIL apakškūpai, ir vajadzeiga šyunu populacejis atteireišona nu izgrīztūs audu. Deļtam myusu šyunu boguotynuošonys metode apvīnuojumā ar masys spektrometreju var snēgt īskotu par metabolitim, kas ir atškireigi boguotynuoti ar T šyunom i audzieja šyunu populacejom atbylstūšūs pacientu paraugūs. Koč i itai metodei ir prīškrūceibys saleidzynuojumā ar fluoresciešonys aktivizātu šyunu sakuortuošonu, dažys metabolitu bibliotekys var tikt ītekmātys rakstureiguos stabilitatis i/voi straujuo apritis uotruma deļ (22). Tok myusu metode varēja identificēt divejus atzeitus imunosupresejis metabolitus, adenozinu i kinureninu, deļtam ka tī storp paraugu veidim ir cīši atškireigi.
Myusu audzieju i TIL apakštipu metabonomiskuo analize snādz vairuok īskotu par metabolitu lūmu olnīku TME. Pyrma tuo, izmontojūt plyusmys citometreju, mes nūsacejom, ka nav atškireibu mitohondreju aktivitatē storp audziejim i CD4 + T šyunom. Tok LC-MS/MS analize atkluoja byutiskys izmainis metabolitu daudzumā storp itom populacejom, kas nūruoda, ka secynuojumim par TIL metabolismu i tuo kūpejū vīlmainis aktivitati ir vajadzeiga ryupeiga interpretaceja. Ūtrkuort, MNS ir metabolits ar leluokū atškireibu storp CD45 šyunom i T šyunom ascitā, na audziejim. Deļtam nūdaleišonai i audzieja atsarasšonys vītai var atškireigi ītekmēt TIL metabolismu, kas izceļ īspiejamū navīndabeigumu nūteiktā mikrovidē. Treškuort, MNS ražojūšuo enzima NNMT ekspreseja golvonūkuort ir īrūbežuota ar CAF, kas ir audzieja šyunys mozuokā mārā, tok nūsacejams MNS leimiņs teik nūvāruots nu audzieja atvasynuotuos T šyunuos. NNMT puormāruotajai ekspresijai olnīku CAF ir zynoma vieža veicynuošonys īdarbeiba, daleji deļtuo, ka veicynoj CAF metabolismu, audzieja invazeju i metastazis (27). Koč i kūpejais TIL leimiņs ir videjais, NNMT ekspresija CAF ir cīši saisteita ar Vēža genoma atlanta (TCGA) mezenhimalū apakštipu, kas ir saisteits ar švaku prognozi (27, 46, 47). Gols golā enzima AOX1, kas ir atbiļdeigs par MNS nūsaškeļšonu, ekspreseja ir īrūbežuota ari iz CAF populaceju, kas nūruoda, ka T šyunom tryukst spiejis metabolizēt MNS. Itī rezultati atbolsta dūmu, ka, koč i ir vajadzeigs tuoļuoks dorbs, kab puorbaudeitu itū atkluojumu, augsts MNS leimiņs T šyunuos var nūruodeit iz imunosupresejis CAF mikrovidis asameibu.
Ņemūt vārā zamu MNS transporteru ekspresejis leimini i nanūsacejamū golvonūs proteinu leimini, kas īsaisteiti MNS metabolismā, MNS kluotbyutne T šyunuos ir nagaideita. Ni NNMT, ni AOX1 navarēja nūsaceit ar scRNA-seq analizi i diveju naatkareigu kohortu mierķtīceigu qPCR. Itī rezultati nūruoda, ka MNS nateik sintezāts ar T šyunom, bet gon absorbāts nu apleicejuo TME. In vitro eksperimenti paruoda, ka T šyunom ir tendeņce uzkruot eksogenū MNS.
Myusu in vitro pietejumi ir paruodejuši, ka eksogenais MNS izraisa TNFα ekspreseju T šyunuos i uzloboj Sp1 saisteibu ar TNFα promotoru. Koč i TNFα ir gon pretaudzieja, gon pretaudzieja funkcejis, olnīku viezī TNFα var veicynuot olnīku vieža augšonu (31-33). TNFα neitralizaceja olnīku audzieja šyunu kulturā voi TNFα signala izsliegšona peļu modeļūs var uzlobuot TNFα mediātu īkaisuma citokinu ražuošonu i nūmīrēt audzieja augšonu (32, 35). Partū itymā gadīnī nu TME atvasynuotais MNS var dorbuotīs kai proīkaisuma metabolits caur TNFα atkareigu mehanismu caur autokrinū cylpu, taidā veidā veicynojūt olnīku vieža rasšonūs i izplateibu (31). Pamatojūtīs iz itū īspieju, TNFα blokada teik pieteita kai potencials olnīku vieža terapeitiskais leidzeklis (37, 48, 49). Kluotyn vēļ MNS ītekmej CAR-T šyunu citotoksicitati pret olnīku audzieja šyunom, snādzūt papyldu pīruodejumus par MNS mediātu imunitatis nūmīriešonu. Kūpā itī rezultati līcynoj par modeli, kurā audzieji i CAF šyunys izdalej MNS uorpusšyunu TME. Izmontojūt (i) TNF izraiseitu olnīku vieža augšonys stimulaceju i (ii) MNS izraiseitu T šyunu citotoksiskuos aktivitatis inhibiceju, tam var byut divejaida audzieja efekta (5D att.).
Nūslāgumā, pīlītojūt straujuos šyunu boguotynuošonys, vīnys šyunys sekvenciešonys i vīlmainis profiliešonys kombinaceju, itys pietejums atkluoja miļzeiguos imunometabolomiskuos atškireibys storp audziejim i ascita šyunom HGSC pacientim. Itei vysaptverūšuo analize paruodeja, ka storp T šyunom ir atškireibys glikozis uzjimšonā i mitohondreju aktivitatē, i identificēja MNS kai našyunu autonomu imunregulejūšū metabolitu. Itī dati ītekmej tū, kai TME ītekmej T šyunu metabolismu cylvāka viezī. Koč i ir ziņuots par tīšu konkurenci par bareibys vīlom storp T šyunom i vieža šyunom, metaboliti var dorbuotīs ari kai natīši regulatori, kab veicynuotu audzieja progreseju i, īspiejams, nūmīrynuotu endogenū imunreakceju. Papyldu itūs regulejūšūs metabolitu funkcionaluos lūmys aproksts var atkluot alternativys strategejis pret audzieju imunreakcejis uzlobuošonai.
Pacientu paraugi i kliniskī dati tyka īgiuti, izmontojūt BC vieža audzieja audu kruotuvi, kū sertificēja Kanadys audu kruotuvis teikls. Saskaņā ar protokolu, kū apstyprynuoja BC vieža pietnīceibys etikys komiteja i Britu Kolumbejis universitate (H07-00463), vysi pacientu paraugi i kliniskī dati dabuoja informātu rakstisku pīkrisšonu voi oficiali atsasaceja nu sovys pīkrisšonys. Paraugi teik globuoti sertificātajā Biobankā (BRC-00290). Detalizātys pacientu raksturojums paruodeits S1 i S5 tabulā. Kriokonservacejai izmontoj skalpeli, kab mehaniski sadaleitu pacienta audzieja paraugu i piec tam īspīstu tū cauri 100 mikronu filtram, kab dabuotu vīnys šyunu suspenseju. Pacienta ascitu centrifugēja ar 1500 apgr./min. 10 minotys 4°C, kab granulātu šyunys i nūjimtu supernatantu. Nu audzieja i ascita dabuotuos šyunys tyka kriokonservātys 50% syltuma inaktivātajā cylvāka AB serumā (Sigma-Oldrihs), 40% RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) i 10% dimetilsulfoksidā. Ituos konservātuos vīnys šyunu suspensejis tyka atkausātys i izmontuotys zamuok apraksteitajai metabolomikai i metabolitu nūsaceišonai.
Piļneiga bareiba sastuov nu 0,22 μm filtrāta 50:50 papyldynuota RPMI 1640: AimV. RPMI 1640 + 2,05 mM l-glutamins (Termo Fišera Zynuotnis), papyldynuots ar 10% syltuma inaktivātu cylvāka AB serumu (Sigma-Oldrihs), 12,5 mM Hepesu (Termo Fišera Zynuotnis), 2 mM l-glutamins (Termo Fišera Zynuotnis) S1. Streptomicina (PenStrep) šķīdums (Termo Fišera zynuotniskais) i 50 μMB-merkaptoetanola. AimV (Invitrogen) papyldynoj ar 20 mM Hepesu (Termo Fišera zynuotnis) i 2 mM l-glutaminu (Termo Fišera zynuotnis). Plūsmys citometra kruosuošonys bufers sastuovēja nu 0,22 μm filtrāta fosfatu buferāta suoļa šķīduma (PBS; Invitrogen), kas papyldynuota ar 3% syltuma inaktivātu AB cylvāka serumu (Sigma). Šyunu boguotynuošonys bufers sastuov nu 0,22 μm filtrāta PBS i papyldynuots ar 0,5% syltuma inaktivātu cylvāka AB serumu (Sigma-Aldrich).
37°C piļneigā bareibā šyunys 30 minotys īkruosuoja ar 10 nM MT DR i 100 μM 2-NBDG. Piec tuo šyunys īkruosuoja ar dzeivuotspiejis kruosvīlu eF506 4°C 15 minotys. Atkuortuoti suspendēt šyunys FC blokā (eBioscience) i Brilliant kruosu buferā (BD Biosciences), atšķaideit plyusmys citometra kruosuošonys buferī (saskaņā ar ražuotuoja nūruodejumim) i inkubēt 10 minotys ustobys temperaturā. Šyunys īkruosoj ar antivīlu kūpu (S2 tabula) plyusmys citometrejis kruosuošonys buferī 4°C 20 minotys. Pyrma analizis atkuortuoti suspendēt šyunys plyusmys citometrejis kruosuošonys buferā (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R konfiguraceja). Izmontojit SpectroFlo i FlowJo V10, kab analizātu šyunu skaita datus, i izmontojūt GraphPad Prism 8, kab izveiduotu datus. 2-NBDG i MT DR videjuo fluoresciešonys intensitate (MFI) tyka lognormalizāta, piec tam statistikys analizei tyka izmontuots puorī t tests, kab jimtu vārā saskaņuotūs pacientus. Izjimt nu analizis vysys populacejis ar mozuok kai 40 nūtykumim; īraksteit MFI vierteibu 1 sevkurom nagativom vierteibom pyrma veikt statistikys analizi i datu vizualizaceju.
Kab papyldynuotu augšuok pīmynātuo procesu paneļa manualū vuortu strategeju, mes izmontuojom pylnu anotaceju ar formys īrūbežuošonys kūku (FAUST) (21), kab automatiski pīškiertu šyunys populacejai piec myrušūs šyunu likvidiešonys FlowJo. Mes manuali puorvoldom izvadi, kab apvīnuotu populacejis, kas, ruodīs, ir napareizi sadaleitys (apvīnojūt PD1+ ar PD1 audzieja šyunom) i saglobuotuos populacejis. Kotrā paraugā ir videji vaira nakai 2% šyunu, kūpā 11 populacejom.
Fikola gradienta bleivuma centrifugaceju izmontuoja, kab atdaleitu PBMC nu leikocitu atdaleišonys produktu (STEMCELL tehnologejis). CD8 + T šyunys tyka izolātys nu PBMC, izmontojūt CD8 MicroBeads (Miltenyi) i paplašynuotys piļneigā vidē, izmontojūt TransAct (Miltenyi), 2 nedelis saskaņā ar ražuotuoja nūruodejumim. Šyunom ļuove nūstuot 5 dīnys piļneigā bareibā, kas satur IL-7 (10 ng/ml; PeproTech), piec tam otkon stimulēja ar TransAct. dīnā saskaņā ar ražuotuoja nūruodejumim šyunu boguotynuošonai treis kuortuos piec kuortys izmontuoja cylvāka CD45 MicroBeads (Miltenyi). Šyunys tyka alikvotātys plyusmys citometrejis analizei (kai apraksteits īprīkš), i vīns miļjons šyunu tyka alikvotāts treis reizis LC-MS/MS analizei. Paraugi tyka apstruoduoti ar LC-MS/MS, kai apraksteits tuoļuok. Mes nūviertējom tryukstūšū metabolitu vierteibu ar jonu skaitu 1000. Kotru paraugu normalizej ar kūpejū jonu skaitu (TIC), logaritmiski puorvierš i automatiski normalizej MetaboAnalystR pyrma analizis.
Kotrys pacienta vīnys šyunys suspenseja tyka atkausāta i filtrāta caur 40 μm filtru piļneigā vidē (kai apraksteits īprīkš). Saskaņā ar ražuotuoja protokolu, treis pozitivuos atlasis kuortys piec kuortys ar magnetiskū krellis atdaleišonu, izmontojūt MicroBeads (Miltenyi), kab boguotynuotu paraugus CD8+, CD4+ i CD45- šyunom (iz lada). Eisuok sokūt, šyunys teik atkuortuoti suspendeitys šyunu boguotynuošonys buferā (kai apraksteits īprīkš) i skaiteitys. Šyunys inkubēja ar cylvāka CD8 krellim, cylvāka CD4 krellim voi cylvāka CD45 krellim (Miltenyi) 4°C 15 minutis, piec tuo izmozguoja ar šyunu boguotynuošonys buferi. Paraugs teik izlaists cauri LS kolonai (Miltenyi), i teik apkūpuotys pozitivuos i nagativuos dalis. Kab samazynuotu ilgumu i palelynuotu šyunu atveseļuošonuos sūli, piec tam CD8 frakceju izmontoj CD4+ boguotynuošonys ūtrajā kuortā, bet CD4 frakceju izmontoj turpmuokajai CD45 boguotynuošonai. Turēt šķīdumu iz lada vysu atdaleišonys procesu.
Kab sagataveitu paraugus metabolitu analizei, šyunys vīnu reizi izmozguoja ar ladaini soltu suoļa šķīdumu, kotram paraugam pīvīnuoja 1 ml 80% metanola, piec tam vierpuļuoja i īsaļdeja škidrajā sluopeklī. Paraugi tyka pakļauti treis sasaļšonys-atkauseišonys ciklim i centrifugāti ar 14 000 apgr./min. 15 minotys 4°C. Supernatantu, kas satur metabolitus, iztvaikoj leidz sausam. Metaboliti otkon izškeide 50 μl 0,03% mudrskuobis, vierpuļuoja, kab sajauktu, i piec tam centrifugēja, kab nūjimtu atkrytumus.
Izjimt metabolitus, kai apraksteits īprīkš. Pīlīc supernatantu iz augstys veiktspējys škidruos hromatografejis pudelis metabolomikys pietejumim. Izmontoj najaušu apstruodis protokolu, kab apstruoduotu kotru paraugu ar leidzeigu šyunu skaitu, kab nūvārstu partiju efektus. Veicom kvalitativu globalūs metabolitu nūviertiejumu, kas īprīkš publicāts AB SCIEX QTRAP 5500 treiskuoršuo kvadrupola masys spektrometrā (50). Hromatografiskuo analize i pīku laukuma integraceja tyka veikta, izmontojūt MultiQuant versejis 2.1 programaturu (Lītuotūs biosistemys SCIEX).
Jonu skaits 1000 tyka izmontuots, kab nūviertētu tryukstūšū metabolita vierteibu, i kotra parauga TIC tyka izmontuots, kab apriekinuotu kotra atkluotuo metabolita normalizātū maksimalū laukumu, kab korigātu izmainis, kū īvīse instrumentaluo analize nu parauga apstruodis. Piec TIC normalizacejis logaritmiskajai puorviersšonai i automatiskajai normys linejis mārūguošonai teik izmontuots MetaboAnalystR(51) (nūklusātais parametrs). Mes izmontuojom PCA ar veganu R paku, kab veiktu izpietis analizi par metabolomu atškireibom storp paraugu veidim, i izmontuojom daleju redundaņcis analizi, kab analizātu pacientus. Izmontojit Vorda metodi, kab izveiduotu syltuma kartis dendrogramu, kab sakūpuotu Eiklida attuolumu storp paraugim. Mes izmontuojom limmu (52) par standartizātu metabolitu daudzumu, kab identificātu atškireigi daudzus metabolitus vysā šyunu tipā i mikrovidē. Kab vīnkuoršuotu skaidruojumu, mes izmontojam grupys videjū parametru, kab nūruodeitu modeli, i jem vārā šyunu veidus mikrovidē kai kotru grupu (n = 6 grupys); nūzeimeiguma testa veicem treis atkuortuotus mierejumus kotram metabolitam Lai izavaireitu nu klaidainys replikacejis, pacients tyka īkļauts kai škierslis limma projektā. Kab puorbaudeitu metabolitu atškireibys storp dažaidim pacientim, mes pīlāguojom limma modeli, īkļaunūt pacientus, fiksātā veidā. Mes ziņojam par īprīkš nūruodeituo kontrasta nūzeimi storp šyunu tipu i Padj mikrovidi <0, 05 (Benjamini-Hohberga korekceja).
Piec spāka boguotynuošonys, izmontojūt Miltenyi myrušūs šyunu nūjimšonys komplektu (>80% dzeivuotspieja), vīnys šyunys transkriptoma sekvenciešona tyka veikta iz kūpejūs dzeivūs sasaldātu ascitu i audzieja paraugu, izmontojūt 10x 5′genu ekspresejis protokolu. Tyka analizāti pīci gadīni ar atbylstūšim audziejim i ascitu, koč i zamuo dzeivuotspieja nu vīna audzieja parauga naļuove tū īkļaut. Kab sasnāgtu vairuokys pacientu atlasis, mes apvīnuojom kotra pacienta paraugus 10x hroma kontrollera jūsluos, i analizējom ascitis i audzieja vītys atseviški. Piec sekvenciešonys [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp puorī gols (PE), Kvebekys genoms; videji 73 488 i 41 378 nūlasejumi iz vīnu šyunu attīceigi audziejam i ascitam]], mes izmontuojom CellSNP i Vireo (53) (pamatojūtīs iz CellSNP kai Kūpejais cylvāka SNP (VCF), kū nūdrūšynoj GRCh38, teik pīškierta donora identitate pacienta statuss close's. (IBS), izjamūt napīškiertuos šyunys i šyunys, kas identificātys kai dupleksi i atbylstūši donorus storp ascitu i audzieja paraugim (54 Pamatojūtīs iz itū aizdavumu, mes paturējom treis gadīņus ar boguoteigu šyunu reprezentaceju audziejā i ascitā lejuplūsmis analizei, Biecrans skatera pa5. īgiva 6975 šyunys (2792 i 4183 šyunys nu audzieja i ascitis, attīceigi) analizei Mes izmontojam igraph's (57) Luvena kūpejū tyvuokūs sābru teiklu (SNN), pamatojūtīs iz Jaccard attuolumu leidz kūpys šyunom ar izteiksmi annota tyka manuāli izplateits iz. i vizualizētys ar t-SNE, kas nūteiktys ar CD8A i GZMA ekspresiju, izjamūt apakškūpys ar zamu ribosomu proteina ekspresiju Mes pīkļyujom Izar et al (16) publicātajim datim, tymā skaitā jūs t-SNE īgulšonai, var kontrolēt ekspresijis puorsakluošonu storp imunšyunu.
PBMC tyka atdaleiti nu leikocitu atdaleišonys produktu (STEMCELL tehnologejis) ar Fikola gradienta bleivuma centrifugaceju. CD3 + šyunys tyka izolātys nu PBMC, izmontojūt CD3 krellis (Miltenyi). MNS kluotbyutnē voi bez tuo CD3+ šyunys tyka aktivizātys ar plāksnem saisteitu CD3 (5 μg/ml), škeidynojūšu CD28 (3 μg/ml) i IL-2 (300 V/ml; Proleikins). Pādejā paplašynuošonys dīnā ar plyusmys citometreju nūviertēja dzeivuotspieju (fiksātuo dzeivuotspiejis kruosvīla eFluor450, ebiozynuotne) i vairuošonuos (123 skaits ekrellis, Thermo Fisher Scientific). 100 doc#1281 Nūviertēt efektoru funkceju, stimulejūt šyunys ar PMA (20 ng/ml) i jonomicinu (1 μg/ml) ar GolgiStop 4 stuņdis, i uzraudzeit CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4), BioLegend) i TNForeticetiana. (MAb11, BD). Stumulej qPCR i ChIP šyunys ar PMA (20 ng/ml) i jonomicinu (1μg/ml) 4 stuņdis. ELISA supernatantu pyrma i piec stimulacejis ar PMA (20 ng/ml) i jonomicinu (1 μg/ml) 4 stuņdis savuoce.
100 doc#1159 Izmontojūt RNeasy Plus mini komplektu (QIAGEN), izpiļdeit ražuotuoja protokolu, lai izolātu RNS. Izmontojit QIAškeļtuoju (QIAGEN), kab homogenizātu paraugu. Izmontuot lelys jaudys RNS iz cDNS komplektu (Thermo Fisher Scientific), kab sintezātu papyldynojūšū DNS (cDNS). Izmontojit TaqMan strauju uzlobuotū meistarmaisejumu (Thermo Fisher Scientific), kab kvantitativi nūsaceitu genu ekspreseju (saskaņā ar ražuotuoja protokolu) ar itaidom zoņdem: 100 doc#1281 gliceraldehids-3-fosfats nu iudiņraža (GAPDH)] i Hs01010726_m1 (SLC22A2). Paraugi tyka izmontuoti StepOnePlus realajā laikā PCR sistemā (Lītuotuos biosistemys) (Lītuotuos biosistemys) MicroAmp dreizajā optiskajā 96 bedreišu reakcejis plāksnē (Lītišķuos biosistemys) ar MicroAmp optiskū plēvi. Sevkura Ct vierteiba, kas puorsnādz 35, teik skaiteita par viers atkluošonys slīkšņa i teik atzeimuota kai nanūsacejama.
Veikt ChIP, kai apraksteits īprīkš (58). Īsuokumā šyunys apstruoduoja ar formaldehidu (gola koncentraceja 1,42%) i inkubēja ustobys temperaturā 10 minotys. Iz lada 10 minotys izmontoj papyldynuotū pītūpšonys buferi (25 mM Hepes, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl i 0,1% NP-40), tod atkuortuoti suspendej imunonūgulumu buferā, kai apraksteits (58 ). Piec tam paraugs tyka ultraskaņuots ar itaidim ciklim: 10 cikli (20 1 sekuņdis impulsi) i statisku laiku 40 sekuņdis. Inkubēt ChIP pakuopis imunoglobulinu G (šyunu signalizācejis tehnologeja; 1 μl), histonu H3 (šyunu signalizācejis tehnologeja; 3 μl), NFAT (Invitrogen; 3 μl) i SP1 (Šyunu signalizācejis tehnologeja; 3 μl) antivīlys ar parauga šaļti 4° Inkubej ūlboltumvīlu A krellis (Thermo Fisher Scientific) ar paraugu 4°C, maigi kratejūt 1 stuņdi, piec tuo izmontoj heleksa krellis (Bio-Rad), kab boguotynuotu DNS, i izmontoj proteinazi K (Thermo Fisher) ūlboltumvīlu gramuošonai. TNFα veicynuotuojs tyka konstatāts ar PCR: iz prīšku, GGG TAT KCT TGA TGC TG TGT; taišni ūtraiži, GTG CCA AKA AKTS GCC TTT ATA TG (207 bp produkts). Attālus izgataveja Image Lab (Bio-Rad) i kvantitativi nūsaceja, izmontojūt ImageJ programaturu.
Šyunu kulturys supernatantu savuoce, kai apraksteits īprīšk. Nūsoceišona tyka veikta saskaņā ar cylvāka TNFα ELISA komplekta (Invitrogen), cylvāka IL-2 ELISA komplekta (Invitrogen) i cylvāka IFN-γ ELISA komplekta (Abcam) ražuotuoja procedurom. Saskaņā ar ražuotuoja protokolu supernatantu atšķaideja 1:100, kab nūsaceitu TNFα i IL-2, i 1:3, kab nūsaceitu IFN-γ. Izmontojit EnVision 2104 daudzmarku skaiteituoju (PerkinElmer), kab miereitu absorbceju pi 450 nm.
PBMC tyka atdaleiti nu leikocitu atdaleišonys produktu (STEMCELL tehnologejis) ar Fikola gradienta bleivuma centrifugaceju. CD3 + šyunys tyka izolātys nu PBMC, izmontojūt CD3 krellis (Miltenyi). MNS kluotbyutnē voi bez tuo CD3+ šyunys 3 dīnys aktivizēja ar plāksnem saisteitu CD3 (5 μg/ml), škeidynojūšu CD28 (3 μg/ml) i IL-2 (300 V/ml; Proleikins). Piec 3 dīnom šyunys tyka savuoktys i izmozguotys ar 0,9% suoļa šķīdumu, granulys tyka īsaldynuotys. Šyunu skaitu veice ar plyusmys citometreju (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R konfiguraceja), izmontojūt 123 skaitu e-krellis.
Izjimt metabolitus, kai apraksteits īprīkš. Žāluotū ekstraktu atjaunuoja koncentracejā 4000 šyunu ekvivalentu/μl. Paraugu analizej ar apgrīztuos fazis hromatografeju (1290 Bezgaleiba II, Agilent Technologies, Santaklara, Kaliforneja) i CORTECS T3 kolonu (2,1×150 mm, daleņu izmārs 1,6-μm, poru izmārs 120-Å; #186008500). Polarais masys spektrometrs (6470, Agilent), kurā elektrosmiļkšu jonizaceja dorbojās pozitivā režimā. Mobiluo faze A ir 0,1% mudskuobe (H2O), mobiluo faze B ir 90% acetonitrils, 0,1% mudskuobe. LC gradients ir 0 leidz 2 minotys 100% A, 2 leidz 7,1 minotys 99% B, i 7,1 leidz 8 minotys 99% B. Tod otkon īleidzynoj kolonu ar mobilū fazi A ar plyusmys ātrumu 0,6 ml/min 3 minotys. . Plūsmys ātrums ir 0,4ml/min, i kolonys kameru uzkarsej leidz 50°C. Izmontojūt MNA teirū kimiskū standartu (M320995, Toronto pietnīceibys kimiskais uzjāmums, Zīmeļjorka, Ontario, Kanada), kab nūsaceitu saglobuošonys laiku (RT) i puorveiduošonu (RT = 0,882 minotys, puorveiduošona 1 = 137→94,1, puorveiduošona 2 = 137→1372). Kod vysys treis puorejis nūteik pareizā saglobuošonys laikā, 1. puoreju izmontoj kvantitativai nūsaceišonai, kab nūdrūsynuotu specifiskumu. MNA standarta līkne (Toronto Research Chemical Company) tyka izveiduota ar sešim serejis atšķaideišonys kruotuvis šķīdumam (1 mg/ml), kab dabuotu standartus 0,1, 1,0, 10 i 100 ng/ml i attīceigi 1,0 i 10μg/ml škidruo. Atkluošonys rūbežs ir 1 ng/ml, bet linearuo atbiļde ir storp 10 ng/ml i 10μg/ml. Kotru diveju mikrolitru parauga i standarta injekceju izmontoj LC/MS analizei, i ik piec ostoņu injekceju teik palaists jaukts kvalitatis kontrolis paraugs, kab nūdrūsynuotu analizis platformys stabilitati. Vysu ar MNS apstruoduotūs šyunu paraugu MNS atbiļdis beja testa linearajā diapazonā. Datu analize tyka veikta, izmontojūt MassHunter kvantitativuos analizis programaturu (v9.0, Agilent).
Ūtruos paaudzis αFR-CAR konstrukceja tyka jimta nu Song i c. (59). Eisuok sokūt, konstrukcejā ir itaids saturs: CD8a vadeituoja seceiba, cylvāka αFR specifisks vīnys kēdis maineigais fragments, CD8a eņdžis i transmembranys regions, CD27 intracelularais domens i CD3z intracelularais domens. Piļneigū CAR sekveņci sintezēja ar GenScript i piec tuo klonēja ūtrūs paaudžu lentivirusu ekspresejis vektorā augšup pa GFP ekspresejis kaseti, kū izmontuoja, kab nūviertētu transdukcejis efektivitati.
Lentiviruss teik ražuots ar HEK293T šyunu transfekceju [Amerikys tipa kulturys kolekceja (ATCC); audzej Dulbeko modificātajā Eagle bareibā, kas satur 10% augļa gūvs seruma (FBS) i 1% PenStrep, i izmontoj CAR-GFP vektoru i Īpakuojuma plazmidys (psPAX2 i pMD2.G, Addgene) izmontoj tauku fekcejis aminu (Sigma-Aldrihs). Virusu saturūšū supernatantu savuoce 48 i 72 stuņdis piec transfekcejis, filtrēja i koncentrēja ar ultracentrifugaceju. Koncentrātū virusu supernatantu uzglobuot -80°C leidz transdukcejai.
PBMC atdola nu veseleigu donoru leikocitu atdaleišonys produktu (STEMCELL tehnologejis) ar Fikola gradienta bleivuma centrifugaceju. Izmontuot pozitivys atlasis CD8 mikrokrellis (Miltenyi), kab izolātu CD8+ šyunys nu PBMC. Stimulēt T šyunys ar TransAct (Milteņi) i TexMACS bareibā [Milteni; papyldynuots ar 3% syltuma inaktivātu cylvāka serumu, 1% PenStrep i IL-2 (300 V/ml)]. Divdesmit četrys stuņdis piec stimulacejis T šyunys tyka puorvītuotys ar lentivirusu (10 μl koncentrāta virusa supernatanta iz 106 šyunom). 1 leidz 3 dīnys piec transdukcejis iz Cytek Aurora (iz FSC (izklīdis iz prīšku)/SSC (sānu izklīdis), Singlet, GFP+), nūviertej šyunu GFP ekspreseju, kab pīruodeitu transdukcejis efektivitati vysmoz 30% .
CAR-T šyunys 24 stuņdis kultivēja Imunokultā (STEMCELL tehnologejis; papyldynuotys ar 1% PenStrep) itaidūs apstuokļūs: naapstruoduotys, apstruoduotys ar 250 μM adenozinu voi 10 mM MNS. Piec īprīkšapstruodis CAR-T šyunys tyka izmozguotys ar PBS i apvīnuotys ar 20 000 SK-OV-3 šyunom [ATCC; McCoy 5A bareibā (Sigma-Aldrich), kas papyldynuota ar 10% FBS i 1% PenStrep pi 10: Efektora i mierķa attīceiba 1 tyka pastyprynuota treis eksemplarūs papyldynuotajā Immunocult bareibā. SK-OV-3 šyunys i SK-OV-3 šyunys, kas lizētys ar digitalis saponinu (0,5 mg/ml; Sigma-Oldriha), tyka izmontuotys attīceigi kai nagativys i pozitivys kontrolis. Piec 24 stuņžu kūpkultivacejis savuoce supernatantu i miereja laktatdehidrogenazi (LDH) saskaņā ar ražuotuoja nūruodejumim (LDH Glo citotoksicitatis testa komplekts, Promega). LDH supernatantu atšķaideja 1:50 LDH buferā. Nūgalynuošonys procentu miereja, izmontojūt itaidys formulys: nūgalynuošonys procents = korekcejis procents / maksimalais nūgalynuošonys ruodeituojs x 100%, kur korekcejis procents = tikai kūpkulturys-T šyunys, i maksimalais nūgalynuošonys ruodeituojs = pozitivuo kontrole-nagativuo kontrole.
Kai apraksteits tekstā voi materialūs i metodēs, statistiskajai analizei izmontoj GraphPad Prism 8, Microsoft Excel voi R v3.6.0. Ka nu vīna i tuo poša pacienta teik savuokti vairuoki paraugi (par pīmāru, ascits i audziejs), mes izmontojam puorī t testu voi īkļaunam pacientu kai najaušu efektu linearā voi vyspuorynuotā modelī, kai vajadzeigs. Metabolomikys analizei nūzeimis tests teik veikts treis eksemplarūs.
Papyldu materialus itamā rokstā var atrast http://advances.sciencemag.org/cgi/saturs/pylns/7/4/eabe1174/DC1.
Tys ir atkluotys pīkļuvis roksts, kas izplateits saskaņā ar Creative Commons Attribution-Non-Commercial licences nūsacejumim, kas atļaun lītuot, izplateit i reproducēt sevkurā medejā, cikom gola izmontuošona nav komercialam lobumam i pījāmums ir tys, ka originaldorbs ir pareizs. Atsauce.
Pīzeime: Mes tikai lyudzam nūruodeit sovu e-posta adresu, lai cylvāks, kuru īsaceisi lopai, zynuotu, ka gribit, lai jis redz e-postu i ka tys nav spams. Mes naīgiusim nikaidys e-posta adresis.
Itys vaicuojums teik izmontuots, kab puorbaudeitu, voi esi apmaklātuojs i nūvārstu automatisku spama īsnīgšonu.
Marisa K. Kilgura (Marisa K. Kilgura), Sāra Makfersona (Sāra Makfersona), Lorēna G. Zaharija (Lorēna G. Zaharija), Abigeila Eli Aris G. Vatsona (H. Vatsona), Džons Stags (Džons Stags), Breds H. Džounss (Džons Stags), Breds H. Džounss (Breds H. Nelsons), Ralfs Dž. (Rasels G. Džounss), Fīness T. Hamiltons (Fīness T.
MNS veicynoj T šyunu imunūsmīriešonu i ir potencials imunterapejis mierkis cylvāka vieža uorstiešonai.
Marisa K. Kilgura (Marisa K. Kilgura), Sāra Makfersona (Sāra Makfersona), Lorēna G. Zaharija (Lorēna G. Zaharija), Abigeila Eli Aris G. Vatsona (H. Vatsona), Džons Stags (Džons Stags), Breds H. Džounss (Džons Stags), Breds H. Džounss (Breds H. Nelsons), Ralfs Dž. (Rasels G. Džounss), Fīness T. Hamiltons (Fīness T.
MNS veicynoj T šyunu imunūsmīriešonu i ir potencials imunterapejis mierkis cylvāka vieža uorstiešonai.
©2021 Amerikys Zynuotnis atteisteibys asociaceja. vysys tīseibys aizsorguotys. AAAS ir HINARI, AGORA, OARE, KORA, STUDŅUSS, KrystRef i SKAITEITUOJA partneris. Zynuotnis sasnāgumi ISSN 2375-2548.